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利用转基因植物生产疫苗是近年来生物技术领域发展的热点，并且取得了突飞猛进的进展。到目前为止，在转基因植物中表达的抗原基因有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因，肺结核病毒分泌型蛋白MPT64基因，麻疹病毒血细胞凝集素糖蛋白(MV-H)基因等约二十几种。转化的植物品种包括：烟草，马铃薯，拟南芥，大豆，花生，莴苣，胡萝卜，番茄，白三叶草，紫花苜蓿，玉米，海带，羽扇豆等。植物性口服疫苗(oral vaccine)或可食疫苗(edible vaccine)是转基因植物疫苗的研究热点，也是其主要的发展方向，因为植物口服疫苗无需加工提纯和冷冻保存，使用方便，易于推广。植物性口服疫苗对人体实验免疫只是简单地摄食含有疫苗的植物组织，通过机体肠道粘膜作用激发特异性免疫应答，使机体获得对疾病的免疫力。因此受到十分的关注。

本文将介绍植物性口服疫苗这一领域近几年的一些研究进展，并就其中存在的问题以及今后的发展前景作一综述。

1 表达受体范围的扩展

随着植物性口服疫苗研究的深入，转化的受体材料范围不断地扩展，不再局限于模式植物，而扩展到一些可以直接口服(如蔬菜、水果)或蛋白含量较高(如农作物、藻类)的品种。

1.1 蔬菜

由于多数蔬菜具有可以生食，味道鲜美，不含有毒成分，营养丰富等优点，而被优先考虑作为植物性口服疫苗的受体。目前转化成功的有马铃薯、番茄、胡萝卜等等。马铃薯几乎已经成为植物性口服疫苗研究的模式植物，并有许多十分成功的例子，但是由于马铃薯不能被生食，需要加热处理才可以服用，因而大大限制了这一转化受体的使用。番茄是近几年发展起来的一个表达系统，已转化成功的抗原基因有乙肝病毒表面抗原基因、HIVgag和gp基因、狂犬病毒外壳蛋白等，特别是近年来发现了果实特异性启动子，使表达的抗原基因可以集中在果实中，而使目的蛋白的表达量大大地提高。胡萝卜是第一个组织培养成功的植物，同时其遗传转化体系也逐渐趋于成熟，因此也是植物性口服疫苗研究较为理想的受体。Muller等研究了麻疹病毒血细胞凝集素(MH-V)在胡萝卜中的表达情况及其免疫原性和抗原性。目的蛋白通过Western杂交显示，在每克鲜重中约占2μg，其表达的蛋白分子大小比在哺乳动物细胞中表达时约小6kDa，但具有抗原性。空斑降低中和测定(plaque reduction neutralization assay，PRN)实验和流式细胞术试验表明，目的蛋白具有免疫原性，可以激发原初的Th2反应，表明它可以同时激发机体的体液免疫和细胞免疫。这是第一篇关于抗原蛋白在成熟的胡萝卜中表达的报道，并且表达的异源蛋白在小鼠体内具有很好的免疫原性和抗原性。本实验室也研究了口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在胡萝卜中的表达情况(结果未发表)，在双35S启动子的驱动下，VP1基因在胡萝卜的叶片中得到了有效的表达，ELISA实验结果显示表达的抗原可以和相应的抗体特异性地结合，具有活性。近几年来，越来越多的蔬菜品种的遗传转化体系建立起来，如生菜，大白菜，花椰菜等，所以利用转基因蔬菜生产可以直接口服的疫苗具有十分广阔的前景。但是在研究的过程中，也同时存在一些问题：几乎所有的蔬菜其蛋白含量都不是特别丰富，因而限制了抗原的表达量。我们在转基因胡萝卜研究的实验中也曾尝试使用根特异性启动子来提高目的蛋白的表达量，实验仍在进一步的进行中。

1.2 水果

香蕉是世界上第四大类水果，也是最早进行植物性口服疫苗研究的水果。利用果实特异启动子在香蕉中表达疫苗，通过食用植物果实可达到防病的目的。番木瓜是一种分布较广的热带、亚热带水果，可以生食，番木瓜的转化、再生体系早已建立，被认为是目前较为理想的口服疫苗受体植物。周鹏等实现了结核杆菌分泌蛋白ESAT-6在番木瓜中的转化，后续的实验仍在进行中。

1.3 农作物

更适于生产口服疫苗的是那些具有大量可溶性蛋白、耐储存的种子植物。如谷类就非常适合，其胚乳部分富含可溶性蛋白质，能够与种子的其余部分分开，提高了抗原的浓度，降低了服用剂量。目前已在玉米、水稻等农作物中实现了抗原基因的表达。杨振泉等以编码新城疫病毒(俗称“鸡瘟”)融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因，以玉米泛素蛋白启动子(Ubi)为启动子，以潮霉素磷酸转移酶HPT基因作为选择标记基因，β-半乳糖苷酸酶GUS基因作为报告基因，构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV，并通过农杆菌介导转化水稻，获得了多株转基因植株。通过PCR分析和GUS、活性检测，证实含有NDV-F基因的TDNA已整合到水稻核基因组中，为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。

1.4 藻类及其他海洋生物

我国海洋资源丰富，将海洋生物学与生物技术结合起来诞生了海洋生物技术。而藻类生物技术是海洋生物技术的重要组成部分。随着藻类资源工业化生产的建立，人们开始尝试利用转基因的藻类作为生物反应器生产外源蛋白。目前已经遗传转化成功地藻类包括蓝藻、小球藻、螺旋藻、盐藻、海带、裙带菜、紫菜等等，于是植物性口服疫苗的研究由陆地发展到了海洋。乙肝病毒表面抗原已经成功地在海带、蓝藻中表达。姜鹏等在海带中表达乙肝病毒表面抗原，在每毫克可溶蛋白中最高可达2.479μg，约占0.25％，且表达产物具有天然表位。陈天圣等实现了乙肝表面抗原S₂基因在蓝藻S ynechococcus sp. PCC7942中的表达，目的蛋白约为可溶性蛋白的1.1×10^-6～1.5×10^-6。利用藻类作为生物反应器生产口服疫苗可以解决许多其它高等生物难以克服的问题，如目的蛋白表达量低，含有有毒物质不可生食，生长周期长，见效益慢等。但其难以得到纯系，后期纯系的保存及基因丢失现象，应该得到足够的重视。

2 抗原在植物中的稳定性

抗原在植物中表达时，可以被细胞壁保护而免于被蛋白酶消化降解，实现疫苗的“生物胶囊化”。Wright等较早地研究了抗原在植物细胞中的稳定性，证明种子的贮存对抗原的活性没有影响，“生物胶囊化”的疫苗能够长期运输而无需冷藏。随后的一些实验，研究了抗原在大田条件下生长的后代中的稳定性，结果表明，抗原活性不但没有降低，而且抗原的表达量还显著提高。如Tackaberry等研究了人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白B在大田条件下生长的T₁代烟草种子中的表达情况，表明比温室中生长的T₀代提高了30倍，占种子总蛋白的1.07％。Chikwamba等研究了LT-B在转基因玉米后代中的表达情况，表明大田条件下生长的T₃代，LT-B占玉米籽粒可溶性蛋白的3.7％，比温室中生长的T₁代提高了50多倍(0.07％)。Lee等研究了牛运输热病毒在白三叶草中的表达情况，表明大田生长的白三叶草与温室生长的白三叶草相比，抗原的表达量相同。种子50℃烘干后，在室温下保存一年抗原仍保持活性。

3 植物性口服多价疫苗

利用转基因植物生产口服疫苗可以实现多价疫苗，即吃一种植物可以同时抵抗多种疾病。Yu等研究了霍乱毒素B单位(CT-B)和A2单位(CT-A2)分别融合两种不同的抗原：轮状病毒肠毒素NSP4和肠毒素大肠杆菌菌毛抗原CFA/I，将其共同转化马铃薯，得到可以同时抵抗霍乱病毒(CT)，轮状病毒(RV)，肠毒素大肠杆菌(ETEC)的植物性口服多价疫苗。饲喂小鼠，血清中特异性的IgG和肠道中特异性的IgG和IgA滴度明显上升。

4 抗原在质体中的表达

利用叶绿体遗传转化实现抗原在叶绿体细胞中的高效表达是近年来发展的亮点。Daniell等首先实现了CT-B在烟草叶片叶绿体细胞中的表达，结果显示正确组装的CT-B五聚体占可溶蛋白的4.1％。而Tregoning等将破伤风病毒的C片段(TetC)转化烟草的叶绿体细胞，结果表达量最高达可溶蛋白的25％。喂食小鼠产生特异性的抗体。随着质体转化技术的不断完善，利用质体转化系统生产口服疫苗的研究将不断深入。

5 抗原基因与油体基因的融合表达

大多数植物种子含有油体，在油体上装配有一种称作油质蛋白(oleosin)的特异蛋白质，油质蛋白是一种高亲脂性蛋白质，它在许多种子中高水平表达并锚定在油体上。将外源基因与植物的油体特异调控基因融合表达，既提高了外源蛋白的表达量，又可简化蛋白提取纯化步骤，展示了利用植物大规模生产外源蛋白包括生产基因工程疫苗的诱人前景。

目前已有一些实验结果报道利用植物油体表达系统表达外源蛋白，如将β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因与油质蛋白的前860bp核苷酸序列(包括油质启动子和油质蛋白的部分编码序列)连接，插入根癌农杆菌的双元载体pCGNl559中，融合基因在芸苔中成功表达，80％GUS的活性分布在油体上。所以下一步可以将抗原基因与油质蛋白融合表达，实现抗原基因在油体中的集中表达，方便抗原基因的纯化及提高抗原基因的表达量。

6 发展前景与存在问题

植物性口服疫苗的发展前景十分广阔，但仍然有几个问题需要特别地关注。

6.1 抗原在转基因植榇中的形态学表现

资料研究表明，许多抗原的外壳蛋白可以组装成病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，它们虽然缺乏遗传物质，却可以组装成在形态上，抗原性质和稳定性上类似于病毒的粒子，而引发比可溶性抗原更强烈的粘膜免疫反应，避免免疫耐受性，因而形成病毒样颗粒是引发粘膜免疫最有效的手段。但目前许多实验结果都未对抗原在转基因植物中的存在形式进行形态学的鉴定，这可能会使实验结果存在一些潜在的问题。例如，目前研究较多的口蹄疫病毒疫苗，其表达的基因集中在结构基因VP1上，而FMDV病毒粒子是由几个亚单位构成的复合结构，不可能由单个的VP1肽组装成稳定的病毒样颗粒。因此在植物中表达的未组装的VP1亚单位疫苗用作口服疫苗就受限制。尽管它保留了保护性表位，但有可能以可溶性形式存在，而引发机体的免疫耐受性，这一点急需试验来证明。

6.2 改变免疫方法提高机体的免疫反应

由于抗原的表达量偏低，所以有限的蛋白会被蛋白酶水解，而失去免疫原性，经吸收后，达不到诱导机体产生抗体反应(初次免疫应答)的浓度，而失去作为疫苗的价值。所以植物性口服疫苗可以作为一种免疫增强剂，即在机体接种减毒疫苗并免疫反应下降后，口服植物性疫苗，达到增强免疫的效果。这一点在很多的试验中已经得到了证明。

6.3 植物性口服疫苗的管理

经过10年的发展，植物性口服疫苗将越来越接近于商品化、市场化与产业化，作为一种转基因产品对其正确的管理应提前考虑。首先它不同于普通的食品和蔬菜，而是一种药品，因此不能像普通的食品随意地使用，而应在医生的建议与监督下有效地食用。第二随着栽种面积的不断扩大，应考虑基因渗漏所引发的环境问题，首先要对其种子严格管理，并应在现有的实验基础上考虑培育雄性不育的株系，以防止花粉飞逸造成的环境污染。

过去10年的发展，使植物性口服疫苗由一个想法逐渐地变成了一个现实，越来越多的实验证明了其可行性。虽然在其发展过程中出现了一些新问题，但其发展前景是光明的。我们完全有理由相信有这样的一天，人类不再需要长距离地冷藏运输疫苗，不再需要用针头注射疫苗，而只是食用一些可口的蔬菜或水果而远离疾病的困扰。

    注：
    （1）文章来源：中国生物工程杂志，2004年第9卷第9期；
    （2）作者单位：中国科学院遗传与发育学研究所。

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