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植物抗病性及其机制研究一直是当今植物病理学和植物抗病育种中的热点和焦点问题。近十年来，植物抗病分子作用机制研究发展较快，主要表现在以下几个方面：1)抗病基因的克隆及其结构分析；2)病原菌无毒基因及相关致病因子的克隆与研究；3)信号传导相关因子的克隆及其结构分析；4)植物一病原菌之间的相互作用研究。

1 抗病基因的克隆及结构分析

抗病基因是植物一病原菌相互关系中的一个关键因子，是抗病机制研究的基础。抗病基因的克隆将有助于更快地揭示寄主与病原菌相互作用的分子机理，推动植物分子病理学与分子生物学的发展。因此，对抗病基因的分离与分析成为当今科技界的热门课题，并已取得显著进展(表1)。据不完全统计，人们已利用不同的方法从各种粮食、经济作物和其他植物中克隆出48个抗病基因。其中大部分基因从双子叶模式植物番茄(Lycopersicum esculentum)和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中获得。在粮食作物中，人们已克隆到15个抗病基因，其中水稻(Oryza sativa)5个，马铃薯(Solanum tuberosum)4个，大麦(Hordeum vulgare)3个，玉米(Zea mays)2个和小麦(Triticum aestivum)1个。值得一提的是，第一个植物抗病基因HM1是从玉米中分离得到的。Johal和Briggs(1992)利用转座子标签法首次从玉米中克隆到抗圆斑病基因HMl。该基因编码依赖于NADPH的HC毒素还原酶，该酶能降解玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)生理小种1所产生的毒素，从而使玉米获得抗性。根据对抗病基因表达产物序列的预测，人们将这些基因分为5类：毒素降解酶、蛋白激酶、核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)/富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)蛋白、胞外受体和受体激酶(Staskawicz等，1995；Baker等，1997；Hammond-Kosack and Jones，1997；Staskawicz等，2001)基因。除前两类外，后3类中都含有LRR结构。

从水稻中克隆到的5个抗病基因包括3个抗白叶枯病基因(Xa-1、Xa-21和Xa-21D)和2个抗稻瘟病基因(Pi-b和Pi-ta)(Song等，1995；Yoshimura等，l998；Wang等，1998，1999；Bryan等，2000)。这些抗病基因都是利用图位克隆法获得的。除Xa-21基因编码受体激酶外，其他4个基因都编码NBS/LRR蛋白。有趣的是籼稻品种中抗病等位基因Pi-ta与感病等位基因pi-ta所编码的蛋白只有一个氨基酸的差异(Bryan等，2000；Jia等，2000)。根据抗病等位基因与感病基因在DNA序列上的多态性，笔者已建立起世界上首个以抗病基因本身序列为特异性引物的DNA显性与共显性分子标记(Jia等，2002，2004)。最近，Jia等(2003)研究发现，抗病等位基因Pi-ta在不同抗病品种间完全相同，而感病等位基因Pi-ta在不同品种间有不同程度的差异。这可能是由于稻瘟病菌与寄主水稻长期相互作用的结果。

目前，许多实验室正在致力于其他稻瘟病抗性基因的克隆研究，如俄亥俄州立大学王国亮领导的实验小组正在克隆抗病基因Pi-2(t)和Pi-9(t)；威斯康辛大学Leong教授实验小组正在致力于AVR1-CO39/Pi-CO39(t)体系的研究；加州大学戴维斯分校Ronald教授领导的小组正在致力于抗病基因Pi-3和Pi-5的克隆；日本国立农业科学研究所Kawasaki教授正在克隆抗病基因Pi-ta²；我国华中农业大学王石平教授也在致力于抗病基因Pi-2(t)的克隆研究。随着水稻基因组草图与精细测序的完成，越来越多的水稻抗病基因将被克隆，从而为水稻抗病分子作用机制研究提供基础。　　　

2 病原菌无毒基因及相关致病因子的克隆与研究 　　　

早在20世纪40年代，Flor博士在研究亚麻锈病抗性的遗传时就提出著名的“基因对基因”假说。此假说的核心内容是对于寄主中的每一个显性抗性基因，在病原菌中就存在相应的显性无毒基因(avirulence，Avr)。一般认为，病原菌无毒基因编码的产物为激发子(elicitor)，而寄主中的抗性基因则编码受体蛋白(receptor)，激发子与受体蛋白特异性结合，诱发寄主防卫反应的表达，从而产生抗性。因此，无毒基因的克隆及其产物的结构功能分析，对于了解病原菌与寄主之间的互作，防卫反应信号在细胞中的传导以及抗病机制的研究都具有非常重要的意义。第一个无毒基因AvrA是Staskawicz等(1984)从细菌中克隆得到的，它来自丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)大豆致病型小种6。据报道，人们已从不同细菌中克隆到3O多个无毒基因(Bonas and van den Ackerveken，1999)。在真菌中，第一个被克隆的无毒基因是番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)中的Avr9基因，其对应的抗性基因为Cf9(van Kan等，1991)。Avr9基因编码的产物是一个含63个氨基酸残基的多肽。将该基因导人到含Cf9抗性基因且对某个特定菌系感病的植株中，结果发现经转化的植株对这一特定菌系产生抗性(van den Ackerveken 等，1992)。这一结果进一步证实了Flor(1971)提出的“基因对基因"假说。

在稻瘟病真菌中，目前已鉴定或克隆的致病性相关因子或无毒基因已超过20个。已克隆的稻瘟菌致病性相关因子和无毒基因包括CUT1、MPG1、PWL1、PWL2、AVR1-CO39和AVR-Pita等。CUT1基因编码一种角化酶，该酶与稻瘟菌菌丝穿透寄主角质层有关(Sweigard等，1992)。MPG1基因是第一个被克隆的稻瘟病菌致病因子，该基因的表达产物是一种疏水蛋白，与细胞表面识别有关(Talbot等，1996)。Sweigard等(1995)利用图位克隆法从稻瘟病真菌Guy11中克隆到第一个水稻稻瘟菌无毒基因PWL2，该基因位于2C连锁群上，与两个黏性标记cos222和A12G1间的遗传距离为3.O cM。该基因编码一个大小为16 kDa且富含甘氨酸的亲水蛋白。在PWL2基因存在的条件下，稻瘟病菌对弯叶画眉草(Weeping love)失去侵染能力。在已克隆或鉴定的稻瘟菌无毒基因中，最值得一提的是AVR-Pita基因，该基因位于连锁群1/2C近端粒不到2.0 kb的物理距离内。据推测，该基因编码一个含223个氨基酸的中性锌结合蛋白酶。将该基因用于转化能侵染日本粳稻品种‘Yashiro-mochi’的稻瘟病菌，结果发现转化菌失去侵染能力。由此表明该基因的确是无毒基因。将该基因导人到含Pi-ta抗性基因且对某个特定菌系感病的植株中，结果发现经转化的植株对这一特定菌系产生抗性(Orbach等，2OOO)。这一结果再一次验证了“基因对基因”假说，同时也为稻瘟病抗性分子作用机制的研究创造了良好的体系。　　

最近，笔者对美国稻瘟病优势生理小种“IB-49”和“IC-17”中的无毒基因进行了分子分析，发现这两个生理小种含有与已克隆的AVR-Pita基因具有很高同源性的片段。初步推断表明，这些同源片段与抗病基因Pi-ta结合可引发抗病反应(Jia，2004)。　　　

3 信号传导相关因子的克隆及结构分析

前面已经提到植物与病原菌相互作用时所遵循的“基因对基因”假说。简单地说，就是寄主植物与病原菌相互作用时，病原菌无毒基因表达产物(作为配体)与寄主植物抗病基因编码蛋白(作为受体)相互识别和结合产生信号分子，这种信号通过一系列信号传递因子或调控因子的传导，最终导致寄主植物细胞特异性抗病防卫反应基因的表达，从而产生抵抗性。因此，信号传导相关因子在抗病机制研究中占有非常重要的位置。世界各国许多学者和科学家都致力于这些信号传导相关因子的研究，并取得显著进展。科学家们已利用各种不同的理化与生物方法从不同植物中筛选鉴定出一大批有关信号传导因子的突变体，并从中克隆出2O多个抗病信号传导相关因子(表2)。这些因子的克隆将为全面了解植物抗病反应的分子机制提供了有利条件。　　　

4 植物-病原菌相互作用的研究

植物和病原菌之间的相互作用机理一直是植物病理学的研究重点与热点课题。它们之间的互作关系可分为非亲和性和亲和性两种(周建明等，1999；郭泽建和李德葆，2000)。尽管植物受到各种各样病原菌的侵袭，在自然界，不亲和性即抗病性仍相当普遍，而亲和性即感病性只是少数和例外，这主要与植物的多重防御体系有关。

植物对外界病原菌的防御体系包括其自身固有的和病原菌诱导的两种。前者主要包括细胞壁的角质、蜡质、木质素、特殊的气孔结构、小分子抗病物质(如毒性脂肪酸、酚类化合物、类萜与类黄酮类植保素以及有关的过氧化物酶、多酚氧化酶与苯丙氨酸解氨酶等)、种子固有的抗真菌蛋白和能与真菌几丁质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等(王钧，1998)。而后一类属于植物第二层防御体系，只有当病原菌突破植物固有的第一道防线时才起作用。病原菌诱导的防卫系统又可分为局部和系统的抗病反应两种。前者主要是指过敏反应(hypersensitive reaction，HR)，即当植物受非亲和性病原菌感染后，侵染部位细胞迅速死亡，使病原菌不易获取养分，同时又诱导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质，从而限制了病原菌的增殖(Hammond-Kosack and Jones，1996)。在HR过程中的细胞死亡，过去称为坏死(necrosis)，现在被认为是编程性细胞死亡(programmed cell death，PCD或Apoptosis)(Dangl等，1996)。而后者是建立在前者基础之上的，又称系统获得抗性(system acquired resistance，SAR)。它是指植物受病原菌侵染后局部的HR会产生一类信号分子，这种信号分子能诱发整个植株防卫基因的表达，从而使植物对更多的病原菌产生抵抗作用。其特点是不出现局部抗性那样的枯斑，却能抗多种病原物引起的病害(Ryals等，1996)。

多年研究结果表明，诱导防卫反应是由植物特异抗病基因介导完成的(Dangl and Jones，2001)。从目前来看，至少有4类不同的作用机制。1)抗病基因编码产物能钝化病原菌侵染时产生的毒素，进而抑制病原菌的繁殖。往往会出现植物局部坏死的症状。这种机制典型的例子就是Johal和Briggs(1992)克隆的世界上第一个植物抗病基因Hm1。该基因能编码依赖于NADPH的HC毒素还原酶，该酶能使玉米圆斑病菌生理小种1所产生的毒素失活，从而使玉米获得抗性。2)显性基因能编码病原菌致病性的靶标物。若植物缺乏该靶标物就会产生抗性。这方面的例子是玉米线粒体基因T-urfl3，该基因不仅能编码与雄性不育有关的蛋白，也能编码与病原菌Bipolaris maydis生理小种T分泌毒素亲和的产物，导致玉米与病原菌发生亲和性互作，即植株感病。而缺乏该基因的玉米品种则抗该种病原物(Braun等，1989)。最近，Vogel等(2002)在拟南芥抗白粉病研究中也发现类似的机制。3)抗病基因表达产物直接引发抗病反应。到目前为止，只在大麦中发现这种作用机制。研究发现，大麦显性基因Mlo编码由534个氨基酸残基组成的分子量为60 kDa含7个跨膜域的膜锚定蛋白，它可能是植物细胞死亡和其他防卫系统的负调控因子，而含隐性基因mfo的植株则能抵抗病原菌Erysiphe graminis f．sp. hordei的侵染(Bfischges等，1997)。4)植物抗性基因表达产物能特异性识别病原菌中相应无毒基因编码的产物，并产生信号分子，这些信号分子经信号传递因子传递后，开启植物防卫基因的表达，最终对病原菌产生抗性。这就是著名的基因对基因假说(Flor，1971)。这种防卫作用机制在植物中普遍存在，也是目前研究最深人的一种作用机制。抗病基因编码的产物与病原菌无毒基因表达产物直接或间接结合后会引发一系列反应，如蛋白磷酸化、Ca⁺⁺浓度变化、活性氧变化、水杨酸变化和离子流等(Yang等，1997)。植物防卫基因的表达主要包括谷胱甘肽S转移酶、过氧化物酶、细胞壁蛋白、蛋白酶抑制剂、水解酶(如几丁质酶和1,3-b葡聚糖等)及涉及次级代谢的病程相关(pathogenesis-related，PR)蛋白和酶等(zhu等，1996)。

目前所克隆的抗病基因大部分都编码LRR-NBS(表1)，而且序列同源性很高（Meyers等，2002)，而病原菌的种类千变万化，植物在诱导防卫反应中如何战胜病原菌侵袭的问题已引起世界各国科学家的普遍关注。近十年来，人们对植物抗病基因表达产物与病原菌中相应的无毒基因编码产物是否直接反应以及植物从病原菌的起始识别到诱发防卫基因表达过程中信号如何传导等问题进行了广泛地研究，并取得了明显进展。据de Wit(2002)和Bogdanove(2002)报道，目前除番茄抗细菌叶斑病基因Pto和水稻抗稻瘟病基因Pi-ta编码的产物能与病原菌中相应的无毒基因表达产物直接作用外，大部分抗病基因表达产物并不能直接与病原物中相应的无毒基因编码产物作用。最近，Mackey等(2002)在拟南芥抗丁香假单胞的基因RPM1抗性机制研究中发现，丁香假单胞中无毒基因AvrB和AvrRpm1编码产物并不直接与抗病蛋白RPM1结合，而是首先与蛋白质RIN4结合形成复合体才能识别抗病基因所编码的蛋白。

人们研究发现，植物抗病基因引发防卫基因表达的信号传导途径是多种多样的，如水杨酸途径(Gaffney等，1993；Delaney等，1994)、茉莉酸途径(Vijayan等，1998)和乙烯途径(Penninckx等，1996)等，涉及许多信号传导相关因子(表2)(Dodds and Schwechheimer，2002；Nishimura and Somerville，2002)。最近，英国和美国等发达国家的几个世界著名实验室在植物抗病机制研究中发现两个抗病信号传导的下游调控因子RARl和SGTl在防卫反应中发挥重要作用(Austin等，2002；Azevedo等，2002)。

随着功能基因组和比较基因组学的不断发展，人们将会对植物细胞与病原菌之间的相互识别机理、各种信号分子信号传导机制以及多种信号传导途径的相互关系有更深入的了解，从而揭示植物抗病分子机制的奥秘，为植物抗病基因工程研究与应用打下坚实的基础，同时也将极大地丰富现代分子生物学的内涵。

    注：
    （1）文章来源：植物学通报，2004年第21卷第5期；
    （2）作者单位：浙江万里学院生物与环境学院。

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