中国水稻信息网 C.N.R.R.I.

自20世纪80年代中期以来，利用转基因技术将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis ，Bt)杀虫蛋白基因导入农作物，使其获得抗虫性的研究已取得巨大进展。水稻本身没有足够抗虫的基因，Bt基因是水稻基因工程中可资利用的主要抗虫非水稻基因库源材料之一。将Bt杀虫蛋白基因转入水稻中，可提高水稻对某一昆虫的抗性。全球有许多实验室在进行转Bt基因水稻的研究工作，有大量文献报道获得Bt转基因抗虫水稻植株， 20多个研究组已生产出Bt水稻。转基因作物正在或已成为害虫防治史上划时代的重大飞跃。培育转基因水稻抗虫新品系，可望成为水稻虫害管理的新方法与途径。

1 转Bt基因水稻及其抗虫性的研究进展

1989年首次报道用原生质体电融合技术成功地将Bt基因导入水稻“台粳209”，紧接着谢道昕用花粉管通道技术成功地将Bt基因导入水稻栽培品种“中花11号”。他们所用的Bt基因都是直接从苏云金杆菌中分离纯化得到的。近15年来Bt基因在水稻中的转化、表达及其转基因植株的鉴定和抗虫性研究已有许多报道，进展较快。

日本植物科学家Fujimoto用电击法成功地将CrylA(b)基因导入粳稻，获得转基因水稻植株，并检测到转Bt基因水稻的毒蛋白含量约占可溶性总蛋白的0.05％，首次报道了经修饰的CrylA(b)基因能在转基因植株中高效表达。并能稳定地遗传到R₂代，饲养实验表明转基因植株对二化螟幼虫的致死率为 10％～50％，对稻纵卷叶螟二龄幼虫的致死率最高达55％。瑞士科学家Wunn用基因枪法将CrylA(b)基因导入籼稻“ IR58”，在R₀、R₁和R₂代对鳞翅目害虫的杀虫效果明显，对二化螟和三化螟的最高致死率为100％，并且指出Bt毒蛋白表达量随着水稻的生长发育而呈逐渐增加的趋势。国际水稻所 Ghareyazie报道了用基因枪法将CrylA(b)基因导入香粳品系“827”，获得的转基因植株的毒蛋白表达量较高，为可溶性蛋白的0.1％，对二化螟与三化螟有较高抗性。该研究指出，应用C₄PEP羧化酶基因为启动子使 Cryl(b)基因在水稻籽粒灌浆期功能叶片中高效表达，而在水稻籽粒(胚和胚乳)中不表达，这一研究结果对解决人类食用转基因抗虫水稻稻谷的安全性问题具有开创性意义。印度科学家Nayak利用玉米泛素转移蛋白基因(Ubi基因) 为启动子，用基因枪法将CrylA(c)基因导入籼稻“IR64”，获得的转基因植株中的毒蛋白表达量约为可溶性蛋白的 0.02％～0.025％，对三化螟的最高致死率为92.4％。Datta等利用基因枪法将CrylA(b)基因分别导入各种籼稻和粳稻中，获得一系列转基因植株，经抗虫性检测，表明这些转基因水稻植株对三化螟幼虫的致死率达100％。加拿大渥太华大学的Cheng报道以Ubi基因为启动子，利用农杆菌介导法成功地将CrylA(b)和CrylA(c)基因导入各种水稻中，获得高效表达的转基因植株，有些转基因植株的毒蛋白含量占总可溶性蛋白的3％。喂虫试验表明转基因水稻植株对二化螟、三化螟幼虫致死率高达97％～100％。经Southern blotting与Northern blotting等方法对 R₀、R₁代植株进行检测，证明抗虫基因在水稻中能稳定遗传和表达。

1995年浙江大学(原浙江农业大学)原子核农所与加拿大渥太华大学合作利用农杆菌介导法成功地将密码子经过优化的Bt杀虫基因CrylA(b)导入了多个水稻品种，通过分子鉴定、抗虫性测定和多代筛选，育成了以晚粳推广品种秀水11为遗传背景的若干农艺性状稳定，转基因遗传稳定。对二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等表现高抗的R₅代转基因水稻品系“克螟稻”。朱常香等用水稻幼胚、愈伤组织作受体，采用PIG 基因枪法，成功地将Bt毒蛋白基因CrylA(b)转入水稻中，获得了符合孟德尔遗传规律的转基因植株，并经抗虫性检测，所获得的转基因水稻叶片浸提液可以抑制棉铃虫的生长发育，转基因植株饲喂的棉铃虫体重增加缓慢，即转Bt 基因水稻对棉铃虫具有较强的抗性。卫剑文等用基因枪法将Bt毒蛋白基因Cryl(b)单独或与大豆胰蛋白酶抑制剂基因(SBTi)一起导入籼稻竹籼B和穗优占两品种中，获得对稻纵卷叶螟抗性增强的转单、双抗虫基因的水稻植株。喂虫试验表明：R₂代转Cryl(b)单基因植株对稻纵卷叶螟二龄幼虫的致死率为73.3％～83.3％， R₂代转Cryl(b)+SBTi双基因的植株对稻纵卷叶螟二龄幼虫的致死率为83.3％～93.3％，即转双基因植株比转单基因植株对稻纵卷叶螟具有更强的抗性。福建省农科院王锋研究员用潮霉素作标记基因，用农杆菌介导法将Bt基因、经修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入水稻品种“明恢86”，获得转Bt单基因和转双基因水稻植株及能稳定遗传的转双基因水稻种子，其目标抗虫谱是螟虫，对稻飞虱也有一定的抗性(待发表)。叶恭银等报道，采用农癌杆菌介导法成功地将人工合成Bt的CrylAb基因导入10余种粳稻品种中，并用离体叶片测定和活体成株测定法评价转CrylAb基因水稻的抗螟性。其实验结果显示转CrylAb基因水稻纯合株系PR16对被检测的二化螟、三化螟和大螟3 种水稻螟虫皆具有明显的高抗性。姚方印等利用PIG基因枪法和农杆菌介导法成功地将Bt基因Cry1Ab连同抗除草剂 Bar基因导入黄准稻区主栽水稻品种“中国91”中，获得5个稳定遗传的转基因水稻新品系。2000年的生产示范表现出良好的抗螟虫和抗除草剂性能。

2 害虫对转Bt基因水稻的抗性产生及抗性管理策略

Bt水稻防治的靶标昆虫主要是鳞翅目幼虫，最重要的是黄色螟虫、二化螟和纵卷叶螟。虽然转Bt基因的遗传工程能保护水稻免遭这几种害虫的危害，Bt水稻品种与其它许多虫害防治技术一样，害虫可以演变对转Bt水稻品种的抗性，从而限制转基因水稻品种对害虫的有效抗性。为推迟昆虫对转Bt基因作物的抗性演变，科学家们已作了广泛深入的探讨，并一致认为“高剂量/避难区(High dose/refuge)”方法是延长Bt作物有效性，进行害虫抗性管理的一种最有希望和可行的方法。

“高剂量/避难区”策略的产生源于昆虫抗性形成的遗传基础。在许多情况下，对杀虫剂的抗性都是由一种昆虫基因中的突变引起的。如果有两种可能的基因(等位基因)类型，即赋予抗性的R突变等位基因和赋予敏感性的S正常等位基因，并且每个昆虫都有两种基因复制品，那么昆虫就有3种可能的基因型SS、RR 和RS。RS昆虫对杀虫剂的反应处于SS和RR昆虫之间，但更相似于SS昆虫的反应，说明R等位基因有部分隐性“避难区”是用来保持群体中敏感性昆虫的非Bt作物植株，可以由栽培了非Bt植株的田间构成，或由Bt植株田间内的非Bt 植株构成。在避难区植株中生存的大量SS基因型昆虫可以与在Bt植株中生存的少量RR基因型昆虫交配，得到的后代将是RS基因型，它们在高剂量Bt植林中摄食时将不能生存。

田间内Bt和非Bt植株的混合可以通过播种混合或者在Bt植株田间内种植保护区植株行来确定。但因为昆虫会在植株间迁移，某些昆虫将在Bt和非Bt植株中取食，会“冲淡”Bt植株中的高剂量滴定度，因此认为在田间内混合并不是保护区的最好类型。Dirie等采用混合播种转crylAb基因水稻与非Bt水稻种子的方法，研究黄色螟虫(YSB)和二化螟(SSB)幼虫在Bt稻和非Bt稻之间的迁移规律，他证明在幼虫的发育过程中，这两种螟虫在Bt稻和非Bt稻之间迁移，因此他认为种子混合播种不是进行抗性管理中维持保护区的最有效的方法。目前的研究提出有效的方法是设立分隔的田间保护区，延迟YSB和SSB对转Bt水稻抗性的隔离保护区田设置在距Bt水稻田l km之内比较适宜。

延迟昆虫对Bt水稻抗性的另一种方法应是转双Bt毒素基因水稻。已克隆了100多个Bt 毒素基因，任何两种Bt毒素彼此间都不太相似，如果在仅含一种高剂量Bt毒素的植株上可以成活的昆虫较少，那么在含有两种高剂量Bt毒素的植株上可以成活的昆虫就更少。Lee等研究认为，Cry1Aa或Cry1Ac与Cry1C或Cry2A间的组合是对付YSB和SSB较好的毒素组合。最近的研究发现Cry1Ab与Cry1C或Cry2A间的组合也是有效的。Makbool等用 Cry1Ac和Cry2A毒素基因对水稻进行了转化，发现转化品系中这两种毒素水平大于叶片可溶性蛋白质的0.5％。发放具有双Bt毒素基因的水稻品种，成功地管理抗性只需较小的保护区。

3 转Bt基因水稻的生态安全性

人类所有的活动，包括政治、经济和军事在内的活动都必须依托于所栖息的生态环境，生态系统为人类提供了必不可少的生命维护系统，提供了从事各种活动所必需的最基本的物质资源。生态安全是指一定区域内人类赖以生存和持续发展的以环境资源为物质基础、以环保产业为救济手段的生态系统的综合平衡。生态安全是国家安全四要素之一，也是其它安全要素得以保障的载体和基础。

3.1 转Bt基因植物的生态风险评价研究进展

转Bt基因水稻是通过现代生物技术产生的转基因生物，是改变了水稻的某些生物学特性、代谢产物甚至某些生命活动的过程而产生的、在自然界暂时尚不存在的水稻新品种，可能给人类和环境带来一定的危险和长期的负面影响。在可能受到影响的功能中，包括最重要的能量流动、物质循环、水循环等一系列重要功能。钱迎倩等对转基因植物释放到农田生态系统及自然生态系统中可能带来的影响以及对造成影响的过程进行了全面的分析，认为转基因植物释放到农田生态系统后潜在的危险包括：增加杀虫剂的使用、产生新的农田杂草、转基因植物自身变为杂草、产生新的病毒、产生新的作物害虫及对非目标生物的伤害几个方面。因此，人们在期待着生物技术给人类带来巨大经济利益的同时，尤其关注转基因作物对非目标生物的危害及对生物多样性产生的威胁。转基因玉米和转基因棉花对非目标生物及生物多样性的影响已有不少报道，如Losey在实验室的研究证明转基因玉米的花粉会伤害君主斑蝶(Danaus plexippus)的幼虫。在农业生态系统中一种重要的害虫天敌绿草蛉 (Chryssoperla carnea)捕食了以Bt玉米为食料的猎物欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和棉贫夜蛾(Spodoptera littoralis)后，其死亡率显著高于对照，发育历期延长。瓢虫捕食以转基因马铃薯为饲料的蚜虫后出现生殖力及存活问题。Bt抗虫棉对棉铃虫幼虫的优势寄生性天敌齿唇姬蜂(Campoletis chlorideae)和侧沟绿茧蜂 (Microplitis sp.)的寄生率、羽化率和蜂茧质量造成严重危害，但却能有效地保护增殖捕食性天敌。转Bt基因棉田昆虫群落的优势种类有较大的变化。对非鳞翅目害虫有间接的影响，对天敌总量无明显影响。棉铃虫已小再是主要害虫，一些刺吸性害虫如棉叶螨(红蜘蛛)、棉蚜、棉蓟马、棉盲蝽等上升为主要害虫。转基因作物的残留物及其在生长过程中和种植过后作物根系本身会对土壤中的微生物和无脊椎动物产生影响。转Bt基因作物残留物及生活植物会增加土壤中crylA(b)的含量，如在13个转Bt玉米品种的分泌液中含crylA(b)杀虫蛋白，这些毒素能在土壤中累积。Bt水稻“克螟稻”花粉对初孵家蚕幼虫的致死率无多大影响，而对家蚕的体重有较大影响，其中三龄期家蚕体重与对照存在极显著差异。但研究者认为，在实际桑稻共作生态环境条什下，Bt水稻“克螟稻”花粉对家蚕生长发育可能不会造成太大影响。但王忠华等的研究则表明，用洒过转Bt水稻“克螟稻”2生米粉的桑叶喂养家蚕，家蚕体重、熟蚕数、结茧数、全茧量和茧层量均明显低于对照，且熟蚕整齐度明显迟于对照。其病理切片电镜分析，用洒过转Bt水稻“克螟稻”2生米粉的桑叶喂养的家蚕，其中肠细胞亚显微结构发生了明显的变化，杯形细胞和圆筒形细胞的微绒毛明显变短、变粗，线粒体和粗面型内质网的数量显著下降。樊龙江的研究则认为，转基因Bt水稻和非转基因水稻植株的花粉飘飞能力没有差异，认为Bt水稻在我国南方养蚕地区推广将可能对家蚕的生长发育造成负面影响。陈晓娟等丁2001至2002年的研究表明：与对照汕优63相比，转Bt抗虫基因水稻抗虫1号、抗虫2号和华恢1 号对田间蜘蛛和水牛生物的数量及种类无显著影响。刘雨芳等2002年至2003年的大面积田间实验表明：转双基因 Cry1Ac与SCK水稻MSA、MSB对其靶标害虫稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)具有极显著抗性，而对非靶标害虫稻飞虱的影响则表现在不同的生长时期刺激或抑制其发生，在晚稻的生长后期，MSA与MSB均明显地刺激褐飞虱 (Nilaparvata lugens)的发生。在水稻的不同的生育期，转Bt基因水稻MSA与MSB对稻田节肢动物群落的结构特征自一定的影响，只是对于不同的指标，其影响的时间与程度有一定的差异。在水稻生长发育的前中期(移栽后第42 d) ，转Bt基因水稻MSA与MSB明显降低稻田节肢动物群落的多样性指数、均匀性指数，提高其优势集中性指数，在生长发育的其它时期，役有明显影响。在生长伞期，能提高稻田节肢动物的发生总数量。对稻田节肢动物的重要物种的组成、群落全体物种组成均无显著影响。转基因抗虫水稻MSA与MSB对稻田捕食性节肢动物亚群落的物种数变化的趋势、物种组成、优势种组成及种群数量没有显著影响。但能提高稻田中捕食性节肢动物的发生数量，尤其在水稻黄熟期能显著提高稻田中捕食性节肢动物亚群落的数量，在成熟收割前期能显著提高稻田中捕食性节肢动物亚群落的物种丰富度。

3.2 转Bt基因水稻的生态风险评价内容

转Bt基因水稻的生态学风险评价可从以下几个方面开展：1)对生物多样性的影响。主要考虑转Bt基因水稻对稻田节肢动物群落结构、物种组成、优势种组成与变化、多样性、均匀性、生态功能及时空动态的影响；2)对靶标害虫与非靶标害虫的抗性与种群动态的影响评价；3)基因表达的时空动态与靶标害虫发生的动态关系评价；4)敏感性基线与监测技术；5)抗性的风险评估；6)繁育基地的生态安全性评价；7)水稻代谢基因组的风险评估。对这些内容进行中长期的研究，对其生态风险作出评估。

4 结束语

生物技术被认为是继工业与计算机革命之后的第3大技术革命，已成为公众的一个主要话题。在遗传学领域“以基因为中心”的生物技术——转基因作物正在或已成为害虫防治史上划时代的重大飞跃。许多国家的20多个研究组已生产出Bt水稻，但大多数都是不具有高剂量毒素的Bt品种。也很少品系具有双Bt毒素基因，这容易引起害虫的抗性。

虽然Stewart ＆ Wheaton认为还没有证据说明在美国种植的转基因作物对环境和人类健康有伤害，但也建议需要设计可信的生态实验研究。如果过去我们更多地注意将农业生物技术与生态研究结合起来，也许今天的公众对转基因作物的态度也完全不同。注册转基因作物，美国环境保护署要求提供转基因作物对关键害虫、害虫天敌和非靶标生物的毒物学研究，并且提供重要信息以供长期研究群落之用，以便于评价Bt技术的潜在影响。但是Bt作物也同其它任何一种害虫防治方法一样，只要它能降低害虫的种群，它势必将对整个生物群落产生某些影响。Bt作物对环境、生物群落的影响有了一些报道，但总体水平仍处在初级阶段。

稻田生物群落是一个以水稻为中心，多种害虫、天敌及中性昆虫参与的复合网络系统。Bt基因水稻的应用，对靶标害虫的控制作用的加强，人为地改变了这个食物网或链上的某些链节，有可能导致稻田生物群落内的食物网络关系如天敌群落结构的变化。转Bt基因水稻将对稻田生态系统(包括稻田生境和廊道生境)的生物群落(天敌、害虫与土壤生物群落等)与生物多样性、迁移规律、生物种群组成与结构、生物量及系统功能等产生什么样的影响，对环境的潜在风险有多大，目前还没有系统详细的研究报告。因此，选择Bt基因水稻-害虫-天敌为模式系统，以稻田生境、稻田廊道生境作为环境支撑系统，除了探明Bt基因水稻对稻田靶标害虫的抗性作用外，开展Bt基因水稻对稻田生境中非靶标害虫、稻田捕食性天敌、寄生性天敌及稻田廊道生境中节肢动物群落影响的研究，明确转Bt基因水稻环境释放的生态安全性，为公众正确认识与评价转Bt基因水稻，以及为政府有关部门决策转Bt基因水稻能否商业化生产提供科学的理论依据，具有十分重要的理论意义与现实意义。

    注：
    （1）文章来源：生命科学研究，2004年第8卷第4期；
    （2）作者单位：湖南科技大学生命科学学院。

(浏览次数：4199)