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水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo)是世界性的重要水稻病害之一，我国每年造成水稻产量损失在10％以上。种植抗病品种是生产上控制水稻白叶帖病的主要措施。但因Xoo致病性的变异和新毒性群体的出现，往往使经过数年培育的抗病品种在推广种植几年后就丧失了抗病性。根据X. oryzae和X. campestris在卵磷脂活性、丙酸钠利用、菌体全蛋白、脂肪酸侧链类型、寄主植物种类、寄生方式和致病表型等方面的差异，认定Xoo是禾本科植物上的模式革兰氏阴性植物病原细菌。Xoo在寄主水稻上寄生致病，常由一套“生态位专一特性(niche-specifictrait)”的基因来决定，如趋化因子 (chemotaxis)、鞭毛编码基因(flagella)、依赖Ⅱ型分泌系统的胞外酶类、与附着(adhesion)有关的EPS以及控制 EPS合成的rpfC基因(regulation of pathogenicity factor)、与黄色素产生有关的pig基因、决定小种一品种专化性的无毒基因(avirulence，avr)以及决定Xoo在非寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response)和在寄主水稻上具致病性的(pathogenicity)hrp基因等。根据这些基因在病程中的作用，常被划分为两类：I类为毒力因子 (aggressiveness deter-minant)，这些基因发生改变，Xoo的致病性要么改变，要么改变不大，要么没有改变；II 类为毒性因子(virulence determinant)，现称为致病性效应因子(pathogenicity determinat，也称TTSS效应分子 )，主要包括Virulence、Avirulence、Hrp蛋白等，主要特征是这些因子是通过由hrp基因编码组成的III型泌出系统(type III secretion system，TTSS)分泌进入水稻细胞中从而导致水稻产生抗感病性。这类基因发生突变，则 Xoo致病性发生显著变化。有关Xoo的毒力因子已有很多论述，本文将重点讨论Xoo的致病性效应分子。

1 Xoo的hrp基因簇和hrp调控网络

Xoo的TTSS效应分子的发掘和hrp致病岛(hrp pathogenicity islands)的遗传学研究是在明确了hrp基因簇结构与功能的基础上进行的。与其它革兰氏阴性植物病原细菌一样，Xoo在非寄主植物上激发 HR和在寄主水稻上具致病性也是由hrp基因决定的。其它植物病原细菌hrp基因已有很好的研究。因Xoo存在严格的限制修饰系统，其hrp基因研究进展较为缓慢。邹华松等依据Xcv的hrp基因簇模式和Zhu等获得的12.2 kb hrp基因片段(含转录单元A、B、C、D)中hrpA基因，克隆了Xoo 23.5 kb并含hrp转录单元hrpA、hrpB、hrpC、hrpD、hrpE和 hrpF的hrp基因簇(AY139029，AY139030)。现有资料表明，Xoo至少有25个hrp基因，分别构成hrp基因簇和hrp调节基因簇，独立存在于Xoo染色体不同区域。Hrp调节基因至少由hrpG、hrp和prhA(资料未发表)构成。根据同源性分析，Xoo的hrp基因簇中有9个基因在动植物病原细菌中高度保守(hrp and conserved，hrc)，分别为hrcC、hrcT、 hrcN、hrcJ,hrcU、hrcV、hrcQ、hrcR和hrcS，推测组成III型泌出系统(type III secretion system，TTSS)负责将致病性效应分子注入水稻细胞中。其它植物病原细菌的TTSS已较为清楚。

植物病原细菌形成特定的寄生致病代谢途径与植物互作。Xoo与水稻互作，需识别水稻细胞来源的信号分子来活化自身的基因。农杆菌Agrobacteriumtumefactens在伤诱导下，可感受植物中乙酰丁香酮类的酚类物质。对酚类信号分子的感受导致了农杆菌毒性基因(vir)的转录活化，从而使T-DNA向寄主细胞中转移。豆科植物一根瘤菌互作中，专一性的植物黄酮类化合物活化共生所需的结瘤基因。除了这些经典的例证之外，目前对Xoo与水稻互作的识别进程还知之甚少。

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae，Pss)、辣椒斑点病菌(X. campestris pv. vesicatoria，Xcv)、茄科青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和Xoo为代表性模式植物病原细菌。基于hrp基因簇的排列和调控系统不同，这5种植物病原细菌被分成两组：I组以梨火疫病菌和Pss为代表，II组以Xcv、Xoo和R.solanacearum为代表。I组的hrp调节基因位于hrp基因簇中，hrp操纵元可由HrpL活化，HrpL可活化启动子中有hrp-或avr-框(GGAACCNA-N14-CCACN NA)的hrp基因或avr 基因。HrpL的活化，还需要hrpR和hrpS基因。但I组的hrp调控网络则表现较大的复杂性。II组(以Xoo为例)的hrp调节基因与hrp基因簇不在染色体同一区域。Xoo中的hrpB-hrpF操纵元可被hrpX调节基因产物活化，HrpX可通过含 PIF(plant induceable promoter)框 (TTCGC-N15-TTCGC)的启动子活化hrp基因或其它毒性基因转录表达，但hrpX 调节基因和hrpA操纵元的表达是受hrpG调节基因产物调控的。hrpG基因发生突变，则Xoo的hrp基因表现为组成型表达。陈功友等研究发现，Xoo和水稻条斑病细菌 (X.o.pv.oryzicola，Xooc)的hrpX基因可交叉互补致病性，但 Xooc的hrpG基因却不能交叉互补Xoo的hrpG突变体的致病性，表明HrpG调控的TTSS效应分子在Xoo病程中起作用。在青枯菌中，hrpG的表达还受PrhJ(paint-regulated hrp)的调控，PrhJ与转录因子LuX/UhpA家族同源。prhJ基因的表达受PrhA调控。PrhA是铁载体受体(siderophore receptor)的同源物，是细菌外膜蛋白组分，感应植物信号分子后信号转导于prhJ上，PrhJ控制hrpG基因的表达。陈功友等在研究Xoo hrp基因时也克隆了prhA基因 (资料未发表 )，现正研究其功能。PrhA是否能感应水稻细胞来源的信号分子，还有待进一步研究。

可以看出，目前以hrp基因为线索进行Xoo致病性研究主要体现在以下几个方面： (1)hrp基因是诱导表达的，Xoo与水稻互作或在hrp诱导培养基上TTSS才能形成，TTSS效应分子才能被分泌，但这一分泌过程是如何进行的还不清楚；(2)Xoo中通过TTSS分泌的致病性效应分子的种类和数量；(3)hrp基因调控网络以及该网络对哪些TTSS效应分子有作用。

2 Xoo的TTSS效应分子

根据目前的研究结果分析，Xoo的TTSS效应分子有如下特征：(1)受HrpX蛋白调控，效应分子编码基因的启动子区域存在PIP-box；(2)效应分子的5'端mRNA存在TTSS泌出信号，并且可以在动植物病原细菌中互置分泌。鉴于此，TTSS是开展Xoo 与水稻互作功能基因组学研究的重要途径。一般认为，通过TTSS的致病性效应分子基因包括4类：(1)avr基因、 (2)vir基因，(3)hrp基因簇中除组成TTSS和与效应分子转位作用有关以外的hrp基因或hpa基因(hrp-associated)以及(4)dsp基因(disease-specific pathogenicity)。这也是目前利用hrp基因簇开展植物病原细菌致病岛 (pathogenicity islands，PAIs)研究的主要内容。cNDA-AFLP技术揭示，辣椒斑点病菌中受HrpG调控的TTSS效应分子有4个，受HrpX蛋白调控的TTSS效应分子有20个。基因组学揭示， R.solanacearum中依赖TTSS分泌的效应分子有51个，其中有些与其它植物病原细菌的avr基因有同源性。Deslandes 等利用酵母双杂交系统(yeast-two hybrid system)发现，R.solanacearum的TTSS效应分子PopP2可以和拟南芥中的抗病基因RRS1-R结合，从而证明 R.solanacearum中存在无毒基因。柑橘溃疡病菌(X. axonopodis pv. citri，Xac)和甘蓝黑腐病菌(X. c．pv. campestris，Xcc)比较基因组学研究发现，Xcc中存在8个无毒基因，Xac中也存在8个无毒基因，有些是相同的，其中avrBs3家族的avr基因在Xac中有3个，Xac基因组中有20个基因的启动子中存在FIP-box。非常有趣的是，Xac和 Xcc基因组中均存在avrPphE和avrBs2基因的同源物。Xcv中已知的TTSS效应分子有17种，属avr基因的有avrBs1、 avrBs2、avrBs3、avrBs4、avrBsT、avrRxv、avrXv3和avrXv4，其产物均依赖TTSS进行分泌。相应地，Xoo中有多少TTSS效应分子，种类有哪些?除了avrXa3、avrXa7、avrXa10、hpa2和hpa1、以及hpaP、hpaA、hpaB和hpaG (AY139029，AY139030)外，目前Xoo的TTSS效应分子还知之甚少，从而对Xoo致病性分子机理研究还处于盲人摸象阶段。以上分析也说明，Xoo与寄主水稻互作时常由一套TTSS效应分子同时起作用。

3 Xoo与水稻互作中的无毒基因

基于基因对基因关系，目前通过遗传学鉴定的水稻抗白叶枯病的抗病基因达20多个，其中仅克隆了Xa1和Xa21。Xa1是病菌诱导表达的基因，匹配的Xoo是日本I号小种，编码的R蛋白含有核苷酸结合序列(nucleotide-binding sequence，NBS)和富含亮氨酸重复域(leucine-rich repeat，LRR)，存在于水稻胞质间。Xa21是组成型表达的，匹配的Xoo是菲律宾6号小种，编码的R蛋白含有胞外的LRR结构域和细胞质内的蛋白激酶 (protein kinase，PK)结构域。Xa21决定的抗病性是系统调节的，对大多数Xoo小种具有抗性，表明其它基因在启始水稻防卫途径时具有作用。Dangl等对avr-R基因互作已有论述。相应地，Xoo中与Xa1和Xa21分别匹配的avr基因还没有被克隆。根据水稻R基因结构上的差异推测，avrXa1和avrXa21也应有所差别。虽然已从菲律宾2号小种中克隆了3 个avr基因，即avrxa5、avrXa7和avrXa1O，和从日本III号小种中克隆了avrXa3基因，但与之分别匹配的R基因没有被克隆。只有avr和R基因相互匹配时才能清楚各自在非亲和互作中的功能。

avrXa3与avrxa5、avrXa7和avrXa10一样，同属黄单胞菌的avrBs3(也称avr/pth)基因家族。avr/pth基因除决定Xoo与水稻的亲和性和非亲和性外，还决定病菌在抗病水稻品种上形成水浸(water soaking)症状。过去认为，avrBs3家族的avr基因3 kb以上，编码34个氨基酸的102 bp重复数大于13个，但avrXa3基因却2670 bp大小，102 bp重复数为8.5，其亮氨酸拉链(lucine zipper ，LZ)、3个核定位信号 (nucleotide localization signals，NLS)和酸性转录活化域(acid transcriptional activation domain，AAD) 与AvrXa7和AvrXa10相同。102 bp重复数与病菌识别匹配的R基因有关。avrXa10的102 bp重复数为15.5，若此部分被置换为avrXa7的25.5个重复，则其能识别匹配的R基因是Xa7而不是Xa10。该家族蛋白C端的NLS和AAD的研究结果提示，分子水平上的识别发生在细胞核内并且该家族蛋白能起转录因子作用。avr/pth家族的蛋白是通过病菌III型泌出系统(type III secretion system)前端的Hrp pilus结构被注入寄主植物细胞中，借助无毒蛋白C端的核定位信号NLS与植物细胞核互作。avr/pth基因产物是两性分子，作为致病性毒性因子时具有寄主种的专化性特征，导致产生水浸状病斑产生，表型上为亲和性互作；若起avr功能，则具有小种-品种专化性特征，导致产生HR，表型上为非亲和性互作。Xoo中到底有多少个avr/pth基因?Xoo基因组学揭示，日本系统I号小种中存在10个avr/pth基因(第一届Xoo-水稻互作功能基因组学国际会议，2004，日本，资料未公布)；本实验室研究发现，水稻条斑病细菌(X.o. pv. oryzicola，Xooc) RS105菌株中存在至少9个avr/pth基因(资料未发表)。这说明过去所建立的Xoo与水稻互作的小种-品种关系只是一个相对概念，还需要对这些avr/pth基因进行突变，形成近等基因菌系(isogenic avr/pth alleles)才能更好地理解Xoo-水稻互作的基因对基因关系，并以此为线索克隆水稻中对应的抗病基因。

虽然按照激发子-受体模式可以解释Xoo的avr/pth基因可与水稻中的R基因互作，但还没有更多的分子证据。Bonus等人发现，AvrBs3进入细胞核之前，需要和植物中的一种输入肽α(impotinα)分子进行结合，才能通过C-端的NLS结合于细胞核上。Xoo的avr/pth基因产物进入水稻细胞中是否有类似结果还不清楚。相应地，Xoo中的avr/pth基因产物在进入水稻细胞之前，也需要某种形式的修饰。Ronald等用Tn5建立Xoo菲律宾 6号小种(PR6)突变体库时发现，raxP和raxQ是AvrXa21活性所需的。PR6缺失raxP或raxQ时，即PR5ΔraxP或 PR6ΔraxQ，在含Xa21的水稻品种上仍具有致病性。raxP和raxQ位于Xoo基因组硫同化基因簇中，分别编码ATP硫化酶(ATP sulfurylase)和腺苷酰磷硫化激酶(adenosine-5'-phosphosulfate(APS)kinase)。该2种酶共同作用产生硫、APS和3'-硫腺苷酰-5'-磷硫化物(3'-phosphoadenosine-5'-phosphosufate，PAPS)的活化形式。这一发现的重要性表现在，硫化作用在决定 avrXa21功能方面起重要作用。现在还不清楚AvrXa21是否发生硫化作用后才有专化性识别作用还是硫化作用参与了 AvrXa21的合成，只有avrXa21基因克隆后才能明确。有一点比较清楚，许多生物体中被硫化的分子是作为专化性的配体或受体在起作用，但疑问的是，AvrXa21是以碳水化合物还是蛋白质形式被硫化后再特异性地与Xa21蛋白胞外 LRR结构域互作的?

4 Xoo TTSS效应分子中的诱导抗病性因子

Xoo诱导植物产生抗病性主要有2种形式：(1)与寄主水稻互作时由avr-R基因介导， (2)与非寄主植物互作时由Xoo中产生的harpin类蛋白介导。这两种形式的诱导抗病性均产生HR，也称非寄主抗性 (nonhost resistance)。avr-R基因介导的抗病性及其信号传导途径已有很多论述。本文将重点介绍harpin类蛋白及其诱导抗病性的分子机理。 Harpin类蛋白的共性是，在非寄主植物上激发HR，富含甘氨酸(G)，对热稳定，对蛋白酶敏感，可启动植物多种抗性信号传导途径，赋予植物多种有益表型。植物病原细菌中编码harpin类蛋白的基因共有2类：(1)hrpW基因编码，C'端具有果胶裂解酶(pectate lyase)特征，在不同属的植物病原细菌中保守。基因组学揭示， R.solanacearum、Xcc和Xac中均存在hrpW基因，Xoo中是否存在hrpW，还有待证实。陆徐忠等人证实，Xoo中存在 25.5 kDa的类harpin，可激发HR和诱导烟草产生对TMV的抗性。(2)C'端不具果胶裂解酶特征的harpin分子，如E. amylovora的hrpN、P. syringae的hrpZ、R. solanacearum的popA，X.oryzae的hpal基因。这类harpin分子的编码基因在不同属植物病原细菌中不存在同源性，在致病性中的作用也存在差别。hrpN突变，E.amylovora的致病性不受影响，hrpZ突变，则P.s.pv.syringae丧失致病性，hpal基因突变，则Xoo的致病性显著降低。王金生等首先明确 Xoo中hpal基因产物为harpin类蛋白。

harpin分子作为非特异性激发子(non-specificelicitor)与植物细胞壁上或膜上的受体结合后导致K⁺/H⁺交换、活性氧进发(active oxygen burst)、内源激素(如salicylic acid，SA)积累、蛋白质磷酸化、病程相关蛋白(Pathogenesis-related Protein，PR protein)基因转录表达和植保素(phytoalexin)合成产生等，在表型上表现出植物细胞编程死亡(programmed cell death，PCD)，在功能上赋予植物产生广谱的系统获得抗病性(Systemic Acquired Resistance，SAR)，不仅对植物病原真菌侵染有抵抗性，而且抗植物细菌和病毒的侵染。不仅如此，harpin分子还可通过植物中乙烯(ethylene)信号传导途径赋予植物生长能力和一定的抗虫性。鉴于harpin分子的多种生物学功能，目前发掘和克隆植物病原菌中HR激发蛋白以及以此为线索解析植物分子免疫途径成为研究的热点领域。发掘和克隆harpin类蛋白基因，将为植物体外应用(直接喷洒使用、构建多功能生防微生物)和植物体内应用(转基因植物)提供基因资源。

5 Xoo致病性变异途径

从进化上看，基因水平转移、基因内重复序列的简单加倍或缺失是植物病原细菌致病性变异的主要途径。植物病原细菌的致病岛是水平转移而来的。Xoohrp基因簇的左端有插入元件IS1114，在hrp 调节基因簇的右端有插入元件IS1051和IS1389(AF329697)，说明Xoo的hrp基因簇和hrp调节基因簇曾经发生了水平转移。Xcv的致病岛研究表明，在hrp基因簇的左端存在与P.syringae类似的EEL基因座(exchangeable effector loci，EEL)，效应分子有ORF1、XopA (Xanthomonans out protein)、ORF4和XopD。EEL基因座是同种植物病原细菌不同小种致病性易发生变异的区域。 Xoo的hrp基因簇左端是否有类似的EEL以及Xoo中的avr/pth基因是如何分布的，目前还不清楚。

在寄主植物抗病性的选择压力下，植物病原细菌往往通过基因内重组，赋予某些致病性效应分子新的功能。Xoo的avrBs3(avr/pth家族)基因家族102 bp重复数不同，如avrXa3是8.5、avrXa7是25.5 和avrXa10是15.5，从而导致识别不同的R基因。序列比较发现，Xoo中编码harpin分子的hpa1基因曾发生了基因内重组。从蛋白质序列上看，来自JXO的harpin比来自PXO86菌株的harpin少1个GGG-GG重复，比来自水稻条斑病细菌的harpin多1个GGG-GG重复；在Xoo的hpa1序列中存在插入元件IS1114和ISXo1的同源序列，hpa1基因中TGCTGTGCCAG 序列在avrXa3中有8次重复，在avrXa10中有15次重复，在avrXa7中有25次重复。这说明，重复序列的简单加倍或发生插入事件等基因内重组常是新的毒性因子产生或毒性因子丧失功能的原因。

水稻是我国的主要粮食作物，Xoo是水稻上重要的原核病原生物，也是模式植物病原细菌。水稻抗白叶枯病近等基因系为Xoo小种标准化鉴别和揭示小种中的avr基因奠定了基础。水稻和拟南芥基因组学揭示，与现在结构已知的抗病基因同源的基因占其基因组的1％～2％，因此推测，目前的水稻近等基因系还不足以将Xoo菌系划分为含单个avr的小种。水稻基因组学研究推动了水稻-病原菌互作的功能基因组学。Xoo是通过TTSS 与水稻互作的。Xoo的TTSS是如何形成的?Xoo基因组中到底有多少TTSS效应分子以及TTSS效应分子有哪些种类?这些 TTSS效应分子是如何通过TTSS注入水稻细胞中从而导致水稻的抗感病性?TTSS效应分子是如何调控表达的?TTSS效应分子与水稻细胞中的匹配受体是如何互作的以及相应的信号传导途径如何?如何利用Xoo中TTSS效应分子和水稻中匹配的受体开展水稻抗病育种?回答诸如此类问题，我国紧迫需要解决Xoo的基因组学。虽然Xac和Xcc的基因组学已经揭示了可能的TTSS效应分子，但它们毕竟是双子叶植物的病原菌，Xoo与水稻互作中必定存在独特的TTSS效应分子。　　

    注：
    （1）文章来源：中国农业科学，2004年第37卷第9期；
    （2）作者单位：南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室。
　

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