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　　作物遗传改良离不开突变体的创造。传统的创造突变体的方法包括自发突变的筛选、物理诱变、化学诱变、插入突变和基因剔除等。90 年代以来发展起来的通过抑制特定基因表达产生突变体的方法为突变体创造提供了新的途径。近年来，转录后基因沉默(PTGS)或RNA干扰(RNAi) 技术研究取得了突破性进展，使利用基因沉默技术创造突变体成为可能。

　　基因沉默(gene silencing)是转基因植物中特定基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现象。一方面，基因沉默为利用遗传操作创造遗传修饰物种(genetically modified organisms，GMOs)造成障碍；另一方面，它又为研究基因功能及植物基因表达调控提供了新途径，即通过有选择地抑制特定基因的表达来创造功能缺失体。可利用反向遗传学方法进一步研究基因的功能，或直接利用创造的特殊性状变异体进行植物改良，同时，在植物发育的不同阶段抑制特定基因的表达，对发育生物学研究也具有重要意义。

　　根据基因沉默发生的时期，基因沉默分为转录水平的基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)和转录后水平的基因沉默 (post-transcriptional gene silencing，PTGS)。前者通常与DNA甲基化有关，表现为mRNA不能正常合成，造成基因失活。有研究表明，外源基因较内源基因更易甲基化，但外源基因甲基化不表达不一定影响内源基因的表达。后者虽能合成mRNA，但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。近年来，随着转录后基因沉默机制的深入探讨，使人们能够利用它有目的地使特定基因降低表达或不表达，PTGS技术在功能基因组学和植物改良中显示出巨大的应用潜力。

1 转录后基因沉默现象的发现及定义

　　转录后基因沉默现象最初发现于植物基因研究中。Napoli等(1990)利用查尔酮合成酶基因CHS转化紫花矮牵牛，预期使花色加深，结果却得到许多浅色和杂色花。Jorgensen等称之为共抑制现象(eosuppression)。随后，Guo等(1995)在线虫的par-1基因研究中，向线虫注射反义 RNA期望造成par-1基因失活，却发现注射正义RNA的对照也出现par基因关闭现象。直到1998年Fire等才明确了造成这种现象的原因是双链RNA的作用，并称之为 RNA干扰(RNA interference)。后来将真菌中的这种现象称为阻抑(quelling)，而在植物中一般称这种由双链RNA诱导的抑制基因表达的现象为转录后基因沉默(PTGS)，动物中则称为RNA干扰(RNAi)。

2 转录后基因沉默的作用机制

　　尽管定义不同，但许多研究表明，植物、动物和真菌等的基因沉默具有相同的作用机理，都是双链RNA(dsRNA)特异性地诱导降解与之同源序列的mRNA，从而特异性地阻断相应基因的表达。 PTGS定义着眼于结果，RNAi侧重其作用机制。

　　关于PTGS的作用机理，人们曾试图套用RNA阈值模型，但对某些现象难以作出合理解释。根据包括植物、果蝇和线虫的生化和遗传分析所提出的 dsRNA模型是目前比较普遍被接受的模型：当 dsRNA进入细胞后，被一种dsRNA特异的核酶内切酶Dicer识别，切割成21～23bp的小片段(short interferencing RNA，siRNA)；siRNA与RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex， RISC)结合，并且作为模板识别目的mRNA；然后mRNA与dsRNA的正义链发生链互换，原先 dsRNA中的正义链被mRNA代替，从RISC-dsRNA复合体中释放出来，而mRNA则处于原先的正义链的位置；Dicer在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21～23bp的dsRNA小片段，与RISC结合，继续对靶RNA进行切割，从而使目的基因沉默。

　　该模型包括的dsRNA被Dicer切割成21～23bp的siRNA(Short interferencing RNA)的过程是基因沉默的核心，dsRNA是基因沉默的诱导因子， siRNA则对引导RNA特异性降解起决定作用。这一模型较好地解释了共抑制、反义RNA介导的基因沉默过程中也出现dsRNA的现象。在发生共抑制的烟草中也鉴定到一些约25bp的RNA，进一步证实了共抑制、反义RNA和hpRNA具有共同的介导PTGS的机制。

　　但该模型中各有关因子的结构、作用部位以及它们的作用方式均尚需进一步研究，随着PTGS作用机制研究的不断深入，将进一步促进PTGS技术的广泛应用。

3 PTGS诱导技术

　　dsRNA可以在体外进行化学合成以及体外转录合成等，也可以通过质粒载体和病毒载体等在组织内表达合成。在植物的功能基因组研究及作物改良中，常用的PTGS或RNAi技术按介导方法包括正义RNA介导的共抑制、反义RNA介导的基因抑制、病毒介导的基因沉默(VIGS)和hpRNA介导的基因沉默。

　　正义RNA介导的共抑制指特定mRNA的单链片段转入植物体后引起的同源基因表达降低的现象。反义RNA指与特定mRNA互补的单链序列片段。反义RNA技术是将与目的基因mRNA互补的单链序列片段克隆在适宜的启动子和终止子之间，人工构建成反义基因表达载体，然后导人生物体。病毒介导的基因沉默(VIGS)是利用病毒将目的基因序列引入寄主植物。VIGS不需要产生能够稳定表达沉默结构的转化植株后代，因而VIGS在大规模基因功能研究方面优势巨大，但VIGS不能稳定遗传，在植物改良中的应用有所局限。

　　Waterhouse等首次明确了dsRNA在植物基因沉默中的关键作用。他们研究发现，同时携带与病毒基因组同源的有义和反义基因的植株比单独具有二者之一的植株抗病性更强。他们又以具有靶基因反向重复序列(IRS)的片段进行植物转化以产生自我互补的dsRNA，发现这种结构比单独有义或反义基因片断转化能更有效地抑制基因表达。目前，构建hpRNA高效克隆和表达载体用于特定基因表达调控是RNAi技术应用研究的热点之一。

　　hpRNA载体导入植物体后，在转录过程中产生 mRNA发卡结构，发卡茎部形成稳定的dsRNA诱导同源的内源基因沉默。如果在靶基因的反向重复序列间加入一段非编码序列，如intron(图1)，在植物体内转录形成含intron的发卡结构(intron splicing hpRNA，ihpRNA)(图2)，则沉默效果与hpRNA相比可从58％提高到90％。

　　hpRNA载体设计过程中，靶基因反向重复片段的长度和位置的选择将影响基因沉默的效率和效果。在植物上一般采用几百bp的靶基因片段构建载体，Matzke等(2003)采用大约300bp的Nos启动子序列反向重复形成的dsRNA与273bp的环就足以诱导产生siRNA，使mRNA转录减少。 Chuang等采用288～409bp的序列片段，也获得良好的抑制基因表达效果。我们在水稻淀粉脱支酶基因的ihpRNA载体构建中采用约500bp的靶基因片段，获得极高的基因沉默效果。显然，这也是植物和动物RNAi技术应用的区别点之一，在哺乳动物中，超过30bp的dsRNA会启动其自身的免疫机制，引起非特异性反应，导致细胞凋亡。

　　一般认为靶基因序列应选择基因编码区片段。但Stoutjeedijk等采用FAD2基因的5'UTR片段也有效地沉默了FAD2的表达。BrummeⅡ等将农杆菌的3'UTR序列的反向重复片段连接于多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因片段用于番茄转化，91％的植株表现出PG基因抑制现象，成熟果实中PG的 mRNA含量降低98％以上。这种方法在拟南芥中应用也非常有效。理论上，选择保守序列片段有可能同时沉默一族基因，选择非保守序列则会提高沉默单个基因的效率。

　　针对某些基因沉默后导致发育异常这一问题，可以设计诱导型基因沉默载体加以解决。在没有诱导剂存在时启动子不工作，当在培养基中加入或叶面喷洒诱导剂时，启动子被激活而产生靶基因沉默。某些靶基因的沉默难以观测到表型变化（如感病性在无病环境下不表现病症)或无典型表型(需要借助化学分析才能检测到成份或含量的变化)。为了易于辨别这种基因的沉默程度，采取在一个 hpRNA结构中同时包含2个基因的策略，使难以辨别表型的基因与另一个易于辨别表型的基因，如种皮颜色基因，同时沉默，后者相当于选择标记，从而可以很容易地通过另一个基因的表型筛选沉默的靶基因（图3）。

　　高通量的hpRNA载体构建为PTGS应用提供了高效的技术保障。Wesley等构建的高通量载体pHELLSGATE(EMBL Acc Nos：AJ311874)含有 Gateway^TM克隆体系的2组重组位点attP1和attP2，两组重组位点在内含子片段两侧反向连接，因而便于利用体外重组酶体系通过一步反应将含有attB1和attB2位点的PCR产物克隆到PHELLSGATE载体上，为大规模植物基因组功能研究提供便利。同时还可以通过更换适当的启动子，如组织特异和诱导型启动子，而达到特定器官或特定发育时期或阶段基因沉默的目的。

4 hpRNA介导的PTGS技术在作物遗传改良中的应用

　　PTGS现象自从明确其作用以来短短几年内受到各个领域的广泛重视，其在功能基因组研究方面的应用潜力引人注目。在线虫和果蝇的功能基因组学研究方面已取得很大进展，人们也在探索其在疾病治疗中的应用。在植物方面的应用以拟南芥基因功能研究和烟草抗病、抗旱等基因筛选为先导，某些商业化应用，如花卉颜色调控，也在进行。迄今为止，PTGS技术在作物改良中的应用主要集中在培育抗病毒作物和改良作物品质方面。

4.1 培育抗病毒作物

　　PTGS现象本身就是植物天然的病毒防御系统。利用基因转化系统将表达与病毒同源的 dsDNA的hpRNA载体整合到植物基因组，表达后就会引起病毒基因组的特异性降解，阻止病毒的复制扩散，获得稳定遗传的抗病毒植物。Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化，获得抗性植株。Abbott等。以大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)的多聚酶基因反向重复序列载体(hpBYDVpol)转化大麦，获得 PAV免疫植株，ELISA检测和田间接种均未检测到病毒。他们还观察到转基因植株同时受到大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)和谷类黄矮病毒(CYDV-PAV) 侵染时，仅表现对前者免疫，而对后者感染，显示出免疫性的序列特异性。

4.2 作物品质遗传改良

　　PTGS技术能否应用于植物改良关键在于产生的变异能否稳定地遗传。Stoutjesdijk等在拟南芥FAD2基因的hpRNA介导的基因沉默研究中证明，基因抑制效果可在子代稳定传递，首次明确了 PTGS技术在作物改良，尤其是种子品质性状改良方面的应用潜力。

　　在此基础上，Liu等利用PTGS技术进行了棉籽油成份的改良研究，通过抑制2个脂肪酸去饱和酶关键基因Δ9-去饱和酶编码基因ghFAD-1 和ω6-去饱和酶编码基因ghFAD2-1的表达，分别将硬脂酸含量从2％～3％提高到40％，油酸从非转基因的15％提高到77％。并首次表明通过上述后代的杂交可获得同时提高硬脂酸和油酸的植株，而且基因沉默程度没有降低。进一步显示出PTGS在农作物改良方面应用的优越性。

　　我们利用PTGS技术进行了淀粉品质的改良研究，旨在通过抑制淀粉生物合成过程中关键酶的活性而改变淀粉的合成途径，从而获得特异淀粉突变体。将构建的含淀粉去分支酶基因反向重复序列结构与胚乳特异表达启动子的载体利用农杆菌介导水稻转化，T1种子发育胚乳的 Western和SDS- PAGE结果证明，有些株系的基因沉默效果达90％以上。

　　此外，Byzova等(2004)利用hpRNA介导的基因沉默技术抑制拟南芥和甘蓝型油菜的花发育相关基因的表达，获得花冠发育为萼片的拟南芥和萼片状花冠的油菜，并且这些性状能够稳定遗传。 Shinjiro等(2003)利用RNAi技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶(CaMXMT1)基因的表达，转基因植物中可可碱含量下降了30％～80％，咖啡因含量下降50％～70％。随着PTGS的作用机制逐步被阐明，提高沉默效率的技术不断改进，PIIGS技术的应用领域将更加广泛。

5 展望

　　随着拟南芥、水稻等植物基因组测序工作的完成以及许多农作物EST资料库的建立，为利用反向遗传学研究基因功能奠定了坚实的基础，同时也为利用PTGS创造植物变异体提供了便利。与传统的理化诱变、插入突变及基因剔除技术等相比，PTGS技术具有以下优越性：(1)特异性。序列特异性地降解同源mRNA，使特定基因功能丧失或降低而不影响其它基因的表达；(2)多效性。可以产生多个基因同时沉默的表型。传统的基因剔除技术只能一次改变一个基因，而RNA干扰可以利用同一基因家族的多个基因具有同源性很高的保守序列这一特性，以保守序列片段为载体构建靶基因，产生整个基因家族同时受到抑制的表型，这一特点也为多倍体植物的基因功能研究和遗传改良提供了有效的新途径；(3)系列性。可以产生基因不同程度降低表达(knock down)的一系列表型，基因部分失活对完全抑制致死的基因功能研究尤其重要；(4)可选择性。抑制基因表达可以控制在发育的任意阶段和任意器官，这可以通过采用不同的启动子，如诱导型或组织特异型启动子来实现，而剔除技术(knock out)则永久性地(全生育时期)，整体(所有器官)剔除了该基因；(5)安全性。整合入基因组的 T-DNA序列为植物的同源序列，不存在基因重组的危险，而且由于不产生新的表达蛋白，所以比其它转基因植物生物安全性更大。

　　因此，PTGS技术在作物改良中具有巨大的应用价值和潜力。尤其是通过抑制作物代谢过程中某些酶的功能从而改变其代谢途径，可以达到调节淀粉、脂肪酸和蛋白质等生物大分子结构和成分的目的。另外，通过调节激素合成和分解途径控制果实或籽粒的成熟和发芽等性状也是 PTGS技术应用的优势领域。

　　同时，也应该认识到PTGS技术中还有许多现象尚待研究，如非同源基因(次级靶基因，secondary target)的同时沉默问题(van Houdt等，2003)，同时还要考虑到转基因植物中T-DNA的插入位点效应对基因沉默效果和效率的影响。另一方面，对大多数作物来说，获得高效的植物转化体系仍是各种基因工程技术包括PTGS技术应用的限制因素。在线虫，利用RNAi技术在基因功能研究方面已取得巨大成就，其原因之一是线虫RNAi可以简单地通过注射dsRNA、RNA浸泡或饲喂产生dsRNA的大肠杆菌而获得。相信随着相关分子生物学技术研究的不断深入，PTGS技术应用也将会更加完善，并在农作物改良中发挥巨大的潜力。

    注：
    （1）文章来源：中国生物工程杂志，2005年25卷第5期；
    （2）作者单位：西北农林科技大学农学院。

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