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　　植物在长期的进化过程中形成了雌配子大大少于雄配子，而雄配子的生活力和耐受力又远远小于雌配子的平衡机制，因此在不良环境下，植物首先作出的反应往往是雄性不育。一般来说，在长期的进化过程中，各种植物的雄配子都形成了较宽的光照和温度等生态因子的存活上下限。而其中往往有一些对光照和温度特别敏感的类型，对于它们在该种植物雄配子的光照和温度的生物学存活上下限之间存在着一个临界值，当低于或高于这个临界值时而表现出稳定彻底的雄配子败育。这种光(温)敏雄性不育现象虽然早在20世纪20年代就已经发现，但只有人们逐渐认识到其对作物杂种优势利用的重要作用，特别是1973年石明松首次发现了光敏雄性不育水稻‘农垦58S’以后，才对光温对雄性不育产生的生物学机理进行较为系统的研究。

　　最初人们选育光(温)敏雄性不育材料主要是为了提高作物杂种优势，因此对光(温)敏雄性不育生物学特性从育种的角度提出了许多标准和要求。随后对其研究逐步深入到光温生态机理、细胞学、生理生化和经典遗传学等不同的方向和层面。其中，Yuan等提出的诱导光(温)敏雄性不育育性转换的光温作用模式，即两个光周期反应的阶段发育理论，不但对光(温)敏雄性不育的生理生化、遗传、育种、不育系的光温鉴定和生态适应具有指导意义，而且对整个植物光周期理论和发育生理学都有重要影响。随着分子生物技术的发展，对光(温)敏雄性不育的研究也逐步深入到了分子水平，才真正开始对光(温)敏雄性不育的调控机理和遗传机制进行探讨。由于在光(温)敏雄性不育研究方面，以水稻的研究最为深入和广泛，完全可以反映这方面的最新成果，因此本文也以水稻为主进行综述和讨论。

1 光(温)敏雄性不育的调控机理

　　对光(温)敏雄性不育调控机理进行研究的着眼点，一般是通过综合分析光(温)敏雄性不育特异的代谢物质和细胞微结构等的变化来提出假说，然后对各个环节进行更加细致的分析，进而不断地修订，使之更加完善。随着大量有关光(温)敏雄性不育的细胞学微结构和生理生化代谢物质的异常变化信息的积累，研究者通过深入分析，对光(温)敏雄性不育的调控机理提出了不少假说。

　　杨万年等通过对光敏细胞质雄性不育小麦育性转换期叶片中的NAD激酶和NADP磷酸酶的分析，发现这两种物质代谢关键酶的活性在长日( 不育)和短日(可育)条件下均具有明显变化。孟祥红等进一步对其花药发育中Ca²⁺的分布进行展示，发现在不同的光周期下也存在着显著的不同，这与Tian等对光敏核雄性不育水稻的研究结果是一致的。马力耕等用生理学方法研究发现，花粉萌发初期Ca²⁺过量进入花粉内部抑制了花粉的萌发，所以这些足以充分显示了Ca²⁺的异常分布是导致雄性败育的重要因素。加之Ca²⁺作为生物信号调控中的第二信使，结合Poovaiah提出的生理变化的钙调节反应模型，因此可以粗略地展现产生光敏雄性不育的调控机理的轮廓：光为原始刺激(包括光长和光强)诱导作为光受体的光敏色素与G蛋白结合，然后同第二信使钙调素共同促使NAD激酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶 )等酶类的活化或抑制，最终通过一系列生理生化反应造成雄性不育(图1)。

　　另一方面，目前大量研究表明：光敏色素是光周期的受体；叶绿体是光(温)敏雄性不育形成过程中承上启下的受体结构；赤霉素和生长素可能是调节育性的化学信使。童哲正是通过对这些研究结果的分析，提出了形成光敏雄性不育的光诱导多级放大损伤理论，该理论认为损伤反应包括四级，第一级是叶片中光敏色素的活性差异，如果活性太高，则对光就极为敏感，这样在长光或强光下就可能更容易对细胞的微结构等造成损伤；第二级反应是由于叶绿体中许多关键酶的编码基因受光敏色素调节，光敏色素活性的异常将致使叶绿体结构发生障碍进而引起光化学反应降低；第三级反应是由于光化学反应的降低引起GAs和IAA等信使物质的剧烈减少；第四级反应是光化学信使作用多个位点，使位点处的结构和功能发生异常变化，最终导致不育；并且其还用一个多因子协同模型来直观地进行展示(图2)。

2 光(温)敏雄性不育的分子生物学研究

　　虽然现在已经提出了比较系统的光(温)敏雄洼不育的作用生理调控模型，并且对其中的一些因子分析已经提供了更加深刻的实验证据，如李念华等对‘农垦58S’的花药中的IAA进行免疫组织化学定位分析，显示生长激素作为重要因子的确参与了光敏雄性不育的形成，但是其中众多的受体和调控因子以及光(温)敏雄性不育基因还未获得。因此尽早分离光(温)敏雄性不育基因和与之相关的调控因子是最终揭示光(温)敏雄性不育分子机理的关键和核心，这也是揭示这一调控网络的基础(图2)。目前常用的克隆技术一般是以对目标基因的等位基因系(池)之间核酸或蛋白质的差异分析为基础建立起来的，如蛋白质功能克隆法、cDNA克隆法和图位克隆法等，因此充分展示具有光(温)敏雄性不育性状的等位基因系(池)的基因组或表达水平上的差异将是分离该类基因的首要条件。同时因为基因和其转录产物的物质组成是核酸，其翻译的直接产物为蛋白质，所以下面就分别从这两种物质的差异特异性上来评述。

2.1 光(温)敏雄性不育蛋白质水平上的特异性分析

　　曹以诚等以‘农垦58S’和‘农垦58N’为对应材料，用双向电泳的方法分析了可育和不育条件下从种子到花药发育这段时期内表达蛋白的特异性，结果表明，在各个时期对应材料之间的蛋白组分均有差异，而以雌雄蕊分化期的差异最大，这可能与这时期的育性转换有关。但对于其他时期的差异，特别是种子，难以解释，可能是与选材和取材的不均一性有关。曹孟良等用同样的方法和处理进行研究，只是选材和取材更加严格，研究结果表明，在营养生长期无显著差异，而在生殖生长期差异显著，特别是在雌雄蕊分化期和花粉母细胞形成期差异最大，花粉母细胞形成后差异又逐渐变小。王志强等也得到相似的结果。但这些都只是考虑到蛋白组分的差异，而没有深入地探讨这些蛋白的功能及产生它们的基因。目前已经从‘农垦58S’中纯化分别得到了35、41、45、60和61 kD等多个特异表达的蛋白。其中王台等对P61微序列分析表明其N 端氨基酸序列与水稻和大麦叶绿体酶的B亚基完全一致，并且通过免疫化学分析获知其受单隐性核基因调控。虽然其曾提出根据所测定的特异蛋白的氨基酸序列合成简并性核苷酸探针以获得全长功能基因的设想，但至今未见相似的报道结果。

2.2 光(温)敏雄性不育基因定位与相关基因的克隆

　　蛋白质双向电泳反映的只是育性特异表达基因的大致趋势，虽然也可以通过蛋白质的提纯和测序来设计简并性探针来获得目的基因，但操作相当繁琐且困难重重，而在核酸水平上用基因克隆技术进行分离目的基因就显得更为直接简便。

　　在分子标记对光(温)敏雄性不育基因进行定位之前，人们就用经典遗传学的方法和生化标记对其进行了染色体定位。但无论是基因标记法还是生化标记法，它们所用的标记数量都极为有限，而且基因标记法所用的标记对植株本身的生活力往往有影响而易造成定位上的偏差。因为分子标记无表型效应且数量多，因此就克服了这些不足。Zhang等用混合极端隐性分群分析法，选取代表整个基因组12条染色体的378个RAPD 和RFLP标记将32001S(其由‘农垦58S’衍生而来)的光敏雄性不育基因定位在第3(pms2)和第7(pms1)染色体上，离这两个位点最近的标记分别为 RG191(7.0 cM)和RG477(3.5 cM)，随后的精细定位获得了一个pms1距离为1.34 cM的分子标记O9。王风平等通过对‘农垦58S’和‘农垦58N’杂交F₂群体的RFLP分析，发现在pms1处无育性基因的分离，证明‘农垦58N’突变成‘农垦58S’是发生在其他位点；随后，Mei等用 RFLP将‘农垦58N’突变成‘农垦58S’的位点定位在第12(pms3)染色体上，并找到了一个距其9.56cM的标记R2708，也说明‘农垦58S’衍生来的32001S并没有获得其光敏雄性不育基因。江树业等用籼型水稻光敏雄性不育系HS-1获得了一个与光敏雄性不育有关的克隆片段，并将该DNA片段用RIL群体定位在距RFLP标记R1553的3.8 cM处。这是目前用分子标记定位结果与经典定位一致的唯一报道，可见对一种材料用分子标记法和常规的方法所定位的结果有很大的出入。究其原因，我们认为：(1)经典遗传定位所用的形态标记对植株本身的生活力有影响而造成偏差，同时因为光敏雄性不育基因为点突变，也极有可能造成RFLP探针标记错误；(2)可能是因为可育与不育的界定不严格，划分标准不一致造成的；(3) 可能是所使用的定位群体遗传背景的差异造成的。

　　在温敏雄性不育基因的定位方面，目前已对8个温敏雄性不育基因进行了分子定位。Wang等采用RFLP技术，将5460S的温敏雄性不育基因定位在第8染色体上，距RFLP标记OPB-19为6.70 cM，命名为TMS1；Ymaguchi等将Norin-PL12中的温敏雄性不育基因定位于第7染色体的RFLP标记 R643和R1440之间，定名为TMS2；Subudhi等将IR32364的温敏雄性不育基因定位在第6染色体的RAPD标记OPAC3640和OPAA7550之间，命名为TMS3 ；Dong等用多种分子标记将TGMS-VN1的温敏雄性不育基因定位于第2染色体上，距其最近的为AFLP标记E5/M12-600(3.3 cM)，并已将其转化为 PCR标记，暂命名为TMS4；与此同时，Reddy等将SA2的温敏雄性不育基因定位在第9染色体的AFLP标记EAA/MCAG和微卫星标记RM257之间，也暂命名为TMS4；Wang等将‘安农S-1’的温敏雄性不育基因定位于第2染色体短臂的R394和RM17之间，并命名为TMS5，其中R394距TMS5为2.5 cM， RM174在该群体中与其共分离；另外Koh等用RFLP标记将一个温敏雄性不育基因定位于第9染色体上的RG451(2.5 cM)和RZ404(3.3 cM)之间，该基因暂定名为MS-H。以上的温敏雄性不育均为隐性基因控制的。在水稻上也发现了一些由显性基因控制的温敏雄性不育系，如8987S和萍乡温敏核不育系等。李仕贵等将水稻8987S的温敏显性核不育基因用RFLP标记定位在第6染色体的RM50和C235之间，并暂命名为TMS；水稻上还发现了一个在低于温度临界值时产生败育的新型温敏雄性不育系，其温敏雄性不育基因被定位在第10染色体的分子标记RM239(3.6)和RG257(4.0)之间，并命名为RTMS1。

　　其实这些由简单遗传控制的光(温)敏雄性不育材料占极少数，绝大多数为多基因控制遗传复杂的光(温)敏雄性不育系，如在生产上已开始应用的‘培矮64S’、‘湘油91S’、‘C49S’和‘小麦的ES’系列等。我们实验室最近用约400个SSR和40个ISSR标记在小麦光(温)敏雄性不育系ES-10中检测到两个光(温)敏雄性不育主效QTLs，这也是首次对多基因控制的光(温)敏雄性不育进行分子定位。

　　总之，虽然对光(温)敏雄性不育基因的定位大部分还是粗略的，但也有个别已定位相当精细。如PMS1、PMS3、TMS1和TMS5，已基本达到了图位克隆的要求。目前已构建TMS1和TMS5相应温敏雄性不育系的BAC文库；其中邱芳等利用与TMS1基因连锁的3个分子标记作探针对5460S的 BAC库进行了筛选，并用不对称PCR技术成功分离了阳性克隆的左右末端序列；PMS1和PMS3的物理图谱已经建立，特别是PMS1，目前其被定位在一个85 kb的BAC库的克隆上。可见，最终分离光(温)敏雄性不育基因已指日可待了。

　　虽然图位克隆可能是分离得到光(温)敏雄性不育基因最常用的手段，但人们还是用其他方法进行了尝试。早在1992年，张力在构建了‘ 农垦58S’和‘农垦58N’的cDNA文库的基础上，利用差式杂交来筛选‘农垦58S’在长日和短日下的特异表达mRNA，结果获得一个在短日(可育) 下特异表达的1.2 kb基因片段，并进行了克隆；江树业等用cDNA-PCR技术从水稻光敏雄性不育系Hs-1中克隆一个与光敏雄性不育有关的基因片段，定名为PRG43，但始终没见到筛库的结果；庄楚雄等用cDNA差减杂交技术从‘安农S-1’分离3个与育性转换有关的基因片段，分别命名为 RP-1、RP-2和RP-3。Murai等发现D²型细胞质光敏雄性不育系(D²)-Norin26具有雄蕊心皮化现象，并认为这是造成不育的最直接原因。为了探明控制该性状的基因，根据MADS盒基因设计探针，对(D²)-Norin26的基因库进行了筛选，结果在N26的基因文库中获得了3个特异的克隆，其中TaMADS51与APS3具有高度的同源性，而AP3是拟南芥中与雄蕊发育有关的基因。另一方面，Ogihara等用RFLP 分析显示(D²)-Norin21与其细胞质供体在线粒体DNA和RNA上均存在着差异，认为核代换使线粒体的DNA发生重排。这也充分说明了细胞质型光(温)敏雄性不育的遗传更加复杂，所以克隆难度更大。1999年，我们实验室根据TaMADS51设计特异性引物，用RT-PCR对 (D²)-Norin26在长日和短日下的花药进行分析，结果获得了在短日(可育)下的3个特异带，故推测在花器官原基发育时期TaMADS5基因在长日下表达受到抑制而导致心皮化，最终造成不育。最近我们除了对ES-10光(温)敏雄性不育基因进行了定位，还用多套家族引物和加长随机引物对其在可育和不育光温条件下的基因差异表达进行了分析，获得多个DD-EST，为揭示光(温)敏雄性不育的遗传机制提供了一定的信息。

3 存在的问题与展望

　　目前虽然获得了大量的光(温)敏核雄性不育相关的基因片段和对不少光(温)敏核雄性不育基因进行了精细定位，但始终没有分离得到一个真正的光(温)敏核雄性不育基因。所以无论用图位克隆还是功能克隆，分离得到完整光(温)敏核雄性不育功能基因是获得突破的关键。目前这一工作正在攻关中，相信不久将会获得满意的结果。

　　虽然目前将光(温)敏雄性不育人为地分为温敏和光敏两种类型，但大量的研究表明：它们的育性均受这两种生态因子共同影响。因此，无论在育种实践中还是对不育的形成机理的研究中，都应该注重光温互作，这是全面地展示这种环境敏感雄性不育的必然。

　　目前在水稻和小麦的光(温)敏雄性不育的发育调控机理研究方面都获得了一些相关的基因片段，并且在水稻上还获得了一些相关的表达产物(蛋白)，为揭示光(温)敏雄性不育的发育调控机理提供了不少的信息。但光(温)敏核雄性不育的形成毕竟是一个极其复杂的发育过程，其中包括一系列基因间、基因与基因表达产物间和基因表达产物间的相互作用。这些基因转录水平上的顺式作用元件和反式作用因子之间的相互作用以及基因产物之间的诱导表达和反馈抑制，构成了产生光(温)敏雄性不育的信息网络调控系统。而要真正弄清在此过程中参与物的作用次序和方式，则需要进行大量全面和深入的研究，因此无论从广度和深度上目前揭示光(温)敏雄性不育的发育调控机理是远远不够的。在广度方面应该进行更加系统地研究，对其进行包括生态学、细胞学和生理生化以及分子生物学等多角度、多层面上的系统研究，有助于获得更全面的信息并且可以相互印证。在深度方面，应该对获得候选基因片段进行全长分析和功能验证以及此过程中基因表达产物的分析等等，以便进行深层次的探讨，同时也为应用提供更直接的理论依据。一旦我们了解了形成光(温)敏雄陛不育的机理或其轮廓中某些关键环节，就可以利用有效的手段创造适合杂种优势利用所需要的遗传材料或通过人为的调控来获得理想的光(温)敏雄性不育。另一方面，由于光温作为植物形态建成不可或缺的重要生态因子，因此光(温)敏雄性不育的形成机理研究成果也将对揭示整个植物的发育机制产生极大的促进作用。从这个意义上来讲，在发育生物学研究日益蓬勃的今天，光(温)敏雄性不育的研究很可能将会成为揭示植物分子发育机理的一个重要突破点，加强这方面的研究将具有更加深远的意义。

    注：
    （1）文章来源：植物学通报，2005年第22卷第1期；
    （2）作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所。

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