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　　真核生物中，基因的转录通常受转录因子的调控。Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物所特有的一类转录因子，在果蝇、美丽线虫和酿酒酵母的基因组中尚未发现有dof基因的存在。它含有一个独特的富含Cys残基的单锌指保守结构域。命名为Dof结构域。日前，已在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了Dof蛋白，在高等植物基因表达调控中起作用。本文简要介绍Dof蛋白和其研究进展。

1 Dof蛋白的结构、与DNA结合特性以及和其他蛋白的相互作用

1.1 结构 各种转录因子通常有一个比较保守的结构域与DNA结合，如亮氨酸拉链结构域、锌指结构域、hemeo结构域等。有的转录因子还包含有多个DNA结合结构域。例如，一些植物MYB蛋白[与DNA(GGTTTAG)_n或类似重复序列结合的蛋白]含有几个非完全重复的DNA结合结构域；植物特异性的WRKY(其结构域含有非常保守的氨基酸序列WRKYGQK)转录因子也有不同数目的WRKY与DNA结合结构域，有人据此将WRKY蛋白分成几个亚类。与MYB蛋白和WRKY蛋白不同，Dof蛋白仅在其N末端有1个52个氨基酸组成的高度保守的Dof结构域，在此结构域中CX₂CX₂₁CX₂C基序形成一个单锌指结构，此单锌指结构中1个Zn²⁺与4个Cys残基共价结合(图1)。Zn²⁺和Cys残基对Dof蛋白的活性是必需的，二价离子螯合剂的存在以及对Cys残基的任何替换都会使Dof蛋白失活，这已在多种Dof蛋白与DNA相互作用的研究中得到证明。此外，南瓜的Dof蛋白中两个芳香族氨基酸Tyr和Trp在南瓜Dof结构域中的位置分别与GATA1锌指蛋白和类固醇受体DNA识别螺旋中的Tyr和His以及两个Phe相同，都起着稳定Dof结构域结构的功能，因而对于南瓜的Dof蛋白与DNA的结合也是必需的。可以推测，不同Dof蛋白与DNA结合的Dof结构域中除了单锌指与DNA结合外，锌指旁边C侧链状结构中某些特定氨基酸也参与和DNA的结合，这些细微的变化有可能决定和不同的DNA序列的结合。Dof蛋白的转录调控结构域位于C末端，如玉米的ZmDof1的转录激活结构域是位于C末端的44个氨基酸残基，其他Dof蛋白如拟南芥的OBP1、OBP2、OBP3和大麦的BPBF在C末端也有转录激活结构域。转录调控结构域的氨基酸序列较为多变，不具保守性，这与Dof蛋白功能的多样性足一致的。综上所述，Dof蛋白通常包含2个主要的结构域：一个位于N末端的保守的DNA结合结构域和一个位于c末端的调控结构域。在这两个结构域之间通常还有1个Ser骨架，可能作为分子铰链连接这两个结构域。

1.2 与Dof蛋白结合的DNA序列特异性 Dof蛋白以其Dof结构域与不同的植物特异性基因的启动子相互作用．在每一个Dof蛋白的DNA结台序列中均存在有AAAG序列，只有个例外，即南瓜中的Dof蛋白AOBP识别AGTA序列。Yanagisawa等采用随机合成的DNA进行了结合位点选择实验，并对玉米的4种Dof蛋白(Dof1、Dof2、Dof3和PBF)的DNA结合序列进行系统分析的结果表明，所有能够和Dof蛋白结合的寡聚核苷酸均含有AAAG序列，而且在这个序列上的任何单个突变都会取消Dof蛋白与DNA结合的特性，这说明AAAG序列是Dof蛋白识别的核心序列。而在此核心序列之外的外侧序列对Dof的DNA结合特性也有一定的影响。如玉米的Dofl和Dof2蛋白与C₄植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)基因启动子上的AAAAG序列有很强的结合能力，与GAAAG序列的结合能力较弱，而与CAAAG序列则不能结合。此外，AAAG的数目对Dof与DNA的结合能力也有影响：2个串联重复的AAAG基序表现出比1个AAAG基序约2倍高的DNA亲和力。但是，外侧序列对Dof-DNA相巨作脂的影响是有限的，仅在某种程度上影响二者的相互作用。目前，这方面的研究很少。其他的转录因子，如蛋白-蛋白之间的相互作用以及转录后的修饰对Dof蛋白与其目标序列的特异性相互作用也有影响。

1.3 Dof蛋白与其他蛋白的相互作用 Dof结构域是一个双功能的结构域，它不仅介导与DNA的结合，而且介导蛋白与蛋白之间的相互作用。这种作用通常影响与DNA的结合，有时Dof与其他转录因子通过与DNA的协同结合作用共同调节基因的转录。Zhang等最先报道了这一蛋白与其它蛋白之间的相互作用，如拟南芥的Dof蛋白OBP1就是通过其与bZIP(basic leucine-zipper)蛋白OBF4、OBF5的特异性相互作用而分离到的，OBP1通过其Dof结构域可以促进OBF与DNA的结合。另个Dof-bZIP的相互作用例子是PBF(玉米的一种胚乳特异性Dof蛋白)与O2(玉米的一种bZIP蛋白，参与胚乳特异性基因的表达)之间的相互作用。此外，O2在胚乳中的另一个靶启动子cyPPDK基因的启动子同时也是叶肉细胞中ZmDof1的靶目标。

　　Dof结构域同样也介导Dof蛋白与其他类型的蛋白之间的相互作用．如Dof蛋白与高流动性基团结合的染色质(chromatin-associated high mobility group，HMG)之间的相互作用，不同HMG蛋白提高Dof蛋白的DNA结合性的程度不同。

　　不同家族的转录因子进行的复合调控可能是对转录因子在体外与体内作用有差异的一个比较合理的解释。Dof结构域的双重功能可能有助于其在体内对靶基因的正确激活或抑制。而蛋白-蛋白之间的相互作用在转录调控中的真正意义还需要体内研究的证据。同样．尽管在Dof结构域中存有保守的氨基酸序列，但并不能说明是什么在决定着蛋白-蛋白之间的相互作用。

　　除了Dof结构域外，Dof蛋白C端区域也是与其他蛋白作用的区域。与保守的Dof结构域不同，C末端变化多样，它很可能通过与不同类型调控蛋白或物质的反应，受不同途径信号的调控而激活或抑制基因的转录。这种多样性可能是Dof功能多样性的基础之一，也能够说明为什么同类Dof基因在同一类功能中起作用。

　　已经确定，玉米Dof1、拟南芥OBP1～3、大麦PBF的转录激活区域定位于每个蛋白多变的的C末端。玉米Dof1的转录激活区不仅作用于植物细胞，也作用于动物和酵母细胞。大麦PBF和SAD(scutellum and aleurone-expressed Dof)还与动植物中均存在的MYB转录因子相互作用。MYB结合位点和Dof结合位点对MYB蛋白激活靶基因的转录都是必需的，表明靶基因转录的调控受多个调控因子的协同作用。

　　以上显示，作为转录因子，Dof蛋白不仅通过Dof结构域直接和DNA结合，并在此区域还与其他调控因子或蛋白结合，由调节与DNA的结合而调控基因的转录，而且与许多转录因子一样，在C末端专门有与其他蛋白或因子结合激活或抑制基因转录的区域。这些不同位点调控的组合可能是Dof蛋白功能多样性的结构基础。

2 Dof蛋白的生物学功能

　　在多种植物特异性基因的启动子中都发现有Dof蛋白结合元件，这表明Dof蛋白有多种功能，参与植物多种生命活动的调控。玉米的Dof1是系列光应答基因的调控元件，包括C₄植物的PEPC基因；玉米的PBF以及与其同源的大麦和小麦PBF转录因子控制胚乳特异性贮藏蛋白基因的表达；拟南芥OBP1在水杨酸和氧化胁迫信号的诱导下，可调控植物防御基因的表达；拟南芥的DAG1和DAG2在种子萌发过程中起调控作用。此外，Dof蛋白还参与调控植物激素应答基因的表达，如烟草的Dof蛋白NtBBF1在顶端分生组织和微管组织中是生长素诱导表达的植物癌基因rolB的激活子。Dof蛋白也参与植物基因的负调控。一个典型的例子是，南瓜的Dof蛋白AOBP结合到生长素诱导表达的抗坏血酸氧化酶基因启动子的沉默子区域后，可抑制其表达。一些受赤霉酸诱导的基因表达过程中也有Dof蛋白参与。例如，水稻的OsDof3可能是种子萌发过程中赤霉酸信号途径的一个组分。最近．有人报道番茄中Dof蛋白参与保卫细胞特异基因的表达调控。尽管Dof蛋白的每一种功能还没有得到完全证实，但它参与植物多种生命过程的调控是毫无疑问的(表1)。

　　玉米Dof1在碳骨架台成中是关键的调控因子；它在拟南芥中过量表达可促进与碳骨架合成有关酶表达的增加，一些氨基酸含量的提高和葡萄糖含量的减少，转Dof1基因的拟南芥植株中氮含量提高30％，在低氮条件下拟南芥生长也可有所改善。Dof蛋白的此类型特定调控功能，为采用基因工程改良农产品品质和植物生长特性提供了可能。

3 Dof转录因子家族的系统发育

　　了解Dof蛋白的进化情况有助于研究它的结构和功能。由于拟南芥和水稻的全基因组序列已经十分清楚，所以目前对Dof转录因子家族的系统发育研究主要集中在这两种植物，它们可分别作为双子叶植物和单子叶植物的代表。根据拟南芥全基因组序列分析推断在其基因组中有37个Dof基因，但在AtDofl.9基因的Dof结构域中有一个中止密码子，因此有人认为是一个假基因。Lijavetzky等将这36个Dof基因分为A、B、C、D 4个同源基因群或亚家族，其中B、C、D 3组又可根据内含子和Dof结构域之外的共同蛋白基序的有无进一步分成几个亚组，如B1、B2、CI、C2.1、C2.2、C3等。水稻的Dof转录因子家族包括30个Dof蛋白，采用与拟南芥同样的方法，水稻的Dof转录因子家族也可分为a、b、c、d4组或4个亚家族。其中，c、d两组又可分为cl、c2、d1、d2、d3几个亚组。为了研究Dof基因家族内部的进化关系，Liavetzky等将来自拟南芥和水稻的66个Dof蛋白综合起来绘制了一个进化树，整棵树的布局包括组和亚组的组织都与拟南芥和水稻各自的进化树很相似。这棵树上显示出可能的直系(直向)同源(orthologous)基因和并系(平行)同源(paralogous)基因以及可能的基因丢失事件。最近，分析基因组范围的结果表明，拟南芥的基因组可能起源于10～20亿年前的4次不同的大规模基因组重复(large-scale genomeduphcafion)。显然，这种基因组的重复会导致Dof基因的大量扩增。例如，在系统发育树上相隔很近的2个Dof基因编码的AtDof3.2和AtDof5.3蛋白有顺序相同的5个保守区域，每个区域只有极少数氨基酸不同，表明这两个基因的产生就是基因组重复后变异的结果。目前，人们对基因扩增与功能的多样性之间关系知道的还很有限，但仍然可以预测，同一个亚组中的基因表现出重叠的或相关的功能，事实也的确如此。如OsDof3是一个在水稻种子萌发过程中受GA诱导而在其盾板和胚乳中特异表达的Dof基因，它和与胚乳发育相关的其他Dof蛋白(PBF、BPBF、WPBF)归为一组；拟南芥的两个关系非常密切的Dof基因DAG1(AtDof3.7)和DAG2(AtDof2.5)都参与种子萌发的调控，尽管它们的作用相反，但仍可归为同一个亚组。因此，研究Dof蛋白系统进化不仅可以揭示Dof基因的起源与分化，而且对预测其功能也有很大的帮助。

4 结束语

　　Dof共同的单锌指结构为转录调控识别启动子中的共有结构，其两侧不同类和亚类的保守序列很可能受各种网络信号调控和通过影响Dof蛋白的空间结构决定特异Dof位点识别的特异功能区，决定Dof识别的特异性和网络信号调控的特异性。所以，研究Dof蛋白各组和亚组中保守序列功能将不仅可为Dof家族基因的结构和功能勾勒出关键的轮廓图．也可为整个信号传递网络的研究积累资料。如果信号调控区域功能能够单独存在，而特定Dof DNA序列的Dof结合蛋白又是已知的，那么，还可以根据需要，人工组合新的Dof调控蛋白，为基因工程提供新的基因。

　　通过近年的研究，人们对Dof转录因子已经有了一定的认识。可以相信，随着基因组大规模测序技术以及比较基因组学的发展，其他植物中的Dof蛋白也将会陆续发现。采用插入突变、RNA干扰(RNAi)以及转基因技术结合植物的表型分析，人们对Dof蛋白具体功能的认识将会更加深入。另外，采用基因瞬时表达分析、迁移率变动实验等手段，进一步阐明Dof蛋白调控功能也应是今后研究这一问题的方向之一。

    注：
    （1）文章来源：植物生理学通讯，2005年41卷第4期；
    （2）作者单位：中国科学院武汉植物园。

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