中国水稻信息网 C.N.R.R.I.

　　水稻基因组测序的全面完成为水稻功能基因组学研究奠定了基础。功能基因组学的特点是大规模、高通量及信息的密集型。据统计，到2005年6月24日所提交的水稻 EST 达406541条，cDNA 序列达478535条(www.ncbi.nlm.nih.gov)；预测在水稻基因组中大约有32000～55000个基因，这些未知基因都需要进一步实验证明)并揭示其功能。建立突变体库是发现新基因并揭示其功能的重要而有效的途径。近年来，用 Ac/Ds 标签系统和 T-DNA 法构建水稻插入突变体库研究其功能已取得了长足的进展，日本(Izawa 等1997；Enoki 等1999)、韩国(An 等2003)、澳大利亚(Upadhyaya 等2002)、荷兰(Greco 等2003)等不同国家都有科学家致力于水稻插入突变体库的构建。我国也有几个研究组建立了水稻 T-DNA 插入突变体库，其中水稻生物学国家重点实验已建立了含有45000个独立株系的突变体库(Zhu 等2003)，用新型 Ac/Ds 标签系统构建水稻插入突变体库也正在研究之中。

1　不同突变体库及其突变体

　　突变体库有不同的分类方法。按照产生突变体的方法大致可分为自发突变体库、理化诱变突变体库和插入突变体库3类，按遗传背景则可分为普通突变体厍、近等基因突变体库和等基因突变体库3类。自发突变体库是在长期的自然选择和人工选择过程中积累起来的，该突变体库包含极为丰富的突变，但是突变体的遗传背景非常复杂，给研究造成很大的困难。将各种自发突变体与同一亲本多次回交构成的近等基因系遗传背景相近，在遗传学研究中发挥了重要作用。而通过理化诱变和生物技术构建的等基因系仅个别或者一些位点的 DNA 结构发生变化，总体的遗传背景是一致的，因此在生物学研究特别是基因克隆和功能研究中受到高度的重视。理化诱变方法简便，突变效率高，突变由 DNA 点突变、缺失、重排或逆转座子转座引起，得到广泛的应用，并已建立了，一些突变体库(McCallum 等2000a，2000b；朱旭东等2004)。但其诱变过程难以控制，一个突变体经常包含多个点突变，突变表型可能由多个点突变引起，增加了功能基因鉴定的难度。插入突变是 T-DNA 或转座标签插入到基因组中后，相应位点基因的功能就可能受到抑制而产生基因敲除(knock out)突变体，插入元件同时又可用作标签从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。T-DNA 、逆转座子标签(retrotransposon tagging)和转座子标签(transposon tagging)是构建插入突变体库的三种主要方法。利用 T-DNA 方法构建插入突变体库，每个转基因植株的产生都是独立的遗传转化事件，是发现基因突变的有效手段。但是构建 T-DNA 插入的大群体需要高效的转基因技术，费钱费功，而且伴有大最的逆转座子转座事件，提高了研究的难度。用逆转座子标签法可以得到大量的插入突变体，但要获得所期望的回复突变体较为困难，并且多拷贝的插入较多，增加了分子鉴定的复杂性。以 Ac/Ds 为代表的转座子标签法既具有 T-DNA 插入突变体库信息量大的优点，又可通过 Ac和Ds 的杂交获得新的转座事件，因此不需要数以十万计的转基因植株，大大减少了转基因的工作量。杂交还避免了 T-DNA 库中存在的逆转座子转座的干扰，显著提高了研究效率，也大大方便了基因功能的研究。

　　植物的表型经常与基因的功能相联系，突变体的表型通过形态学和生理生化水平的变化表现出来，并为不同的代谢过程中相互作用的研究提供可用的信息，是揭示基因功能的切入点。辐射、化学诱变、转座子突变和 T-DNA 插入所引起的突变体绝大部分是目的基因受插入或缺失破坏后所引起的功能丧失的突变体，又称基因敲除突变体。转座子元件、T-DNA 和逆转座子元件的插入可以通过提供 PolyA 位点或改变 RNA 剪接位点扰乱基因的表达或改变启动子的功能，也可以插入到基因内部改变其编码框，产生出不同的蛋白质。如果基因敲除发生在体细胞水平上，会引起植物局部表型的改变，但这种表型不能向后代传递。如果在胚性细胞水平上发生转座或插入并经减数分裂传递给后代，则可能产生可遗传的表型改变。然而由于植物基因组内有大量的重复片段(Lin 等1999；Mayer 等1999)及错综复杂的基因网络，许多同源位点能替代该基因的功能，使得基因敲除不一定引起表型改变。

2　Ac/Ds 的结构及克隆的基因

　　玉米转座子 Ac (activator) 是 McClintock 在研究玉米染色体重排和断裂时发现的，是第一个被发现的可移动的遗传元件，在1983年被克隆(Fedoroff 等1983)。Ac长度约为4.6 kb，带有11 bp不完全的反向重复序列 (IRs)，其单个的转录单元由5个外显子(Exo1～Ex05)组成，编码个3.5 kb的 mRNA，此 mRNA 是一个由807个氨基酸组成的 ORF，即 Ac 转座酶(AcTPase)。Ac 能在自身 AcTPase 的作用下进行转座，但是 Ac 不断自主转座，使转座植株难以稳定，不利于研究。因此研究者将具有自主转座能力的 Ac 加以改造使其能够合成转座酶，但是缺失转座序列，丧失了转座能力。非自主性的 Ds (dissociation) 元件大小约0.4～4 kb，含有 Ac 因子中两端的 IRs 序列和完整的转座序列，但缺失或部分缺失合成转座酶的序列，不具有 AcTPase 活性，所以 Ds 元件单独存在时不能发生转座，只有同时存在 Ac和Ds 时，Ds 才能从原位点切离，插入到新位点中。据此，建立了 AcTPase 诱导 Ds 转座的 Ac/Ds 双元系统。Ds 元件转座时在插入位点产生8 bp寄主序列的重复，同时在原位点产生一个空供体位点(EDS site)(Fedoroff 等1984；Fedoroff 1989)，在回复时这8 bp序列仍然保留。一旦基因被转座元件所标记，此空供体位点将可能接受 Ds 标签的切离而回复表型。切离时所保留的8 bp序列也可能或多或少发生缺失，从而留下切除足迹(footprint)。现已有关于不同的 Ac/Ds 系统产生的水稻表型突变体的报告，例如条纹状(stripe)、白化(albino)、淡绿(virescent)、淡黄绿色(chlorina)、矮化(dwarf)、黄化(chlorasis)、枝梗无小穗(branched floretless I)(Izawa 等1997；Zhu 等2003；Pinheiro 等2005)。目前通过 Ac/Ds 系统克隆的植物基因见表1。

3　Ac/Ds 标签系统的转座行为及其插入突变群体

3.1　Ac/Ds 标签转化载体的完善

　　当 Ac和Ds 同时存在时 Ds 会以一定频率发生转座，这个特点使应用 Ac/Ds 双元系统构建突变体库成为可能，其基本步骤是分别构建含 Ac和Ds 的转基因植株，杂交后从 F₂ 代检出 Ds 发生转座的个体，其后代的 Ac和Ds 如果发生分离，将使 Ds 失去再次转座的能力。因此可以获得稳定的转座子插入突变体用于基因克隆。但是在实际操作中，因为无法根据表型检出转座事件，只得对庞大的 F₂ 群体逐株进行分子检测，这显然是不可行的。我国水稻功能基因组计划将构建突变体库的重点从转座子群体转向 T-DNA 插入突变体库，到最终规定构建含20万个 T-DNA 插入株系的突变体库，从一个侧面反映出对转座子标签系统的无奈。为了克服 Ac/Ds 转座系统实用化的瓶颈问题，国内外许多学者设计了新的 Ac/Ds 转座系统，共同的特点是利用 GFP、GUS 或者除草剂抗性等可见的表型检出发生了转座的个体。

　　应用于水稻的 Ac/Ds 标签系统的遗传转化载体主要有两种类型：一是将 Ac和Ds 构建在同载体中，然后导入到水稻中。另一种是将 Ac和Ds 分别构建在不同的载体中，然后分别导入到水稻中。Greco 等(2003)构建了 BAR⁺SU1^--Gus-GFP 载体(图1)。该载体主要由两部分构成，一部分是不可移动的 AcTPase 结构，另一部分是可以移动的 Ds 转座元件结构。经改造的 Ds 转座元件结构插入到 AcTPase 结构中的 GFP 和2个串联的 CaMV 35S 启动子之间。此载体中的 SU1 是细胞色素 P450 基因家族的一员，能转化除草剂前体 R7042 变成有活性的除草剂，它在此载体中是一个负选标记，用于选择没有 Ac 转座酶来源的植株。GFP 编码种绿色荧光蛋白，在此载体中用于 Ds 转座元件切除的标记，可以监测 Ds 元件的切除。BAR 基因是 Ds 转座元件的阳性选择标记。GUS 可以用于检测基因在不同组织中的表达情况，是增强子捕获的报告基因，能够检测表型没有发生变化的插入突变体。Lox 是一个特异位点重组的基因，可以使两个特异的 Lox 位点重组，诱导 DNA 的重排(如倒位、易位等)和缺失。在后代植株中，未发生转座的植株 GFP 不会表达，只有 Ds 元件发生转座后(图1)，GFP在2个串联的CaMV 35S启动子作用下才会表达，从而鉴定出转座植株。继续在田间选择 BAR⁺SU1^- 后代植株并进行分子鉴定，就可以得到稳定的 Ds 插入突变体。

　　这种类型的载体中含有若干可在田间检测的和分子检测的选择标记，方便了后代中转座植株的选择。并且避免了配制杂交组合这一环节。然而由于 Ac和Ds 构建在同一载体中，导致 Ds 不断自主转座使得后代难以稳定。而且当 Ds 在插入位点附近转座时，Ac和Ds 还可能连锁而选择不到有效突变体。此外 BAR 基因不能区分原始的转基因植株、发生了转座的植株及未发生转座的植株，该系统还受到 GFP和SU1 检测效率的局限，对于水稻饱和插入突变体库的构建显得力不从心，不利于高通量功能基因组学的研究。

　　为了避免 Ac和Ds 构建在同一载体中所造成的缺点，研究者分别构建 Ac和Ds 载体，在各自的载体中插入一些选择标记，分别导入到水稻中，再通过配制 Ac和Ds 杂交组合的方式使Ds转座来构建突变群体。Kolesaik 等(2004)构建了 GFPBAR⁺-GUS 型载体。在 Ac 元件载体中，Ac 是不可移动的，只提供转座酶活性。GFP 可以检测在 F₂ 群体中 Ac 转座酶和 Ds 转座元件不连锁的的植株，是一个负选择标记。在 Ds 元件载体中，BAR 基因检测 Ds 元件的转座，GUS 与三倍剪接受体(A)和一个内含子(I)与 Ds 的3'端相连，有利于基因的捕获。在利用它构建插入突变群体时，首先将获得的含这两个载体的转基因植株杂交，在Ac转座酶作用下，Ds 元件发生转座，选择 GFP 阴性植株，然后用 BAR 基因检测，选择 BAR 基因阳性植株用于构建插入突变群体。在 GFP^-BAR⁺-GUS 型载体构建中，后代植株必须先经过 GFP 检测后再经 BAR 基因检测才能得到可遗传的插入突变体。此载体的适用前提是 Ds 转座的位置较远，如果 Ds 在插入位点附近转座时，Ds 可能和 GFP 连锁而不能得到饱和插入突变群体。

　　为了进一步提高转座后代的选择效率，本研究组和吴瑞等合作，应用 BAR⁺-GUS 型载体构建插入突变体库。此载体的主要特点是把 BAR 基因构建在 Ds 载体中的特定位置，以控制其表达。当 Ds 元件未发生转座时 BAR 基因不能正常表达，只有在 Ds 元件发生转座后 BAR 基因才会表达(图2)，发生转座的植株表现出 Basta 抗性。BAR 基因是后代植株转座选择标记，GUS 可以检测基因在不同组织中的表达，发现表型没有发生变化的插入突变体。利用此载体构建插入突变体库时首先分别构建不可移动的Ac转座酶载体和可以移动的 Ds 载体，独立转入到水稻中。然后选择潮霉素(Hyg)阳性的 Ac或Ds 植株杂交(图2)，F₂代保留同时含 Ac和Ds 的杂种，F₂ 代苗期喷涂 Basta，具有 Basta 抗性的植株即为发生转座的植株，这样在苗期就可以鉴定筛选出 Ds 插入的突变体。此方法简单易行，减轻了工作量，节省了时间和费用，有利于大规模的水稻饱合插入突变体库的构建。

　　通过不同研究者对 Ac/Ds 标签系统遗传转化载体的不断改进，现已可以准确快速地检测出 Ds 切离事件，解决了大规模构建水稻饱和插入突变体库的一个难点。然而在 Ac/Ds 标签系统中，并不是所有的切离的 Ds 都会重新插入到水稻基因组中，只有 Ds 又发生重新插入的切离事件才有意义。这又引出了一个新问题，即如何快速检测出重新插入的事件?到目前为止，还没有报告提到可用于高效地检测Ds重新插入的标记，因此 Ac/Ds 标签系统还有待进一步完善。

3.2　Ac/Ds 系统的转座行为

　　依 Ac/Ds 系统的载体构建方式，研究 Ad/Ds 的转座行为也有两种方法：一种方法是直接把自主性元件Ac构建在载体中，在其自身转座酶作用下自发转座；或者把 Ac和Ds 构建在同一载体中，Ac 缺失转座序列，只起 AcTPase 作用，使 Ds 发生转座，通过转基因植株的不同世代研究 Ac或Ds 的转座行为。另一种方法是 Ac和Ds 构建在不同载体中，通过配制 Ac和Ds 杂交组合激活 Ds 转座。Enoki 等(1999)分析了来源于转 Ac 自主转座元件的4个株系559个植株，有108株含有新的 Ac 转座，4个株系平均转座频率为18.9％。对 R₄～R₇ 代的转座频率的研究表明 Ac 在后代中的转座活性较为稳定。在12个独立的 Ac 转座后代中，有3个不能向后代传递，揭示这3个 Ac 转座可能是由体细胞转座造成的；其余9个能稳定地传递给后代，产生稳定的 Ac 插入。Greco 等(2001)用农杆菌介导法将 Ac 导入水稻，用 GFP 标记监测 Ac 的切除，不同株系独立转座频率为15％～50％。来源于一个单拷贝的植株后代的 Southern blot 分析表明有多个 Ac 元件插入，发生了转座元件的扩增，并且这些插入可以遗传给后代。后代切除足迹分析表明，Ac 元件的拷贝数与 Ac 的切除频率成反比，拷贝数越多，独立切除的频率越低。这同玉米中的研究结果一致(Fedorff 1989)。这种转座元件的扩增可能是由于转座复制后再切离，然后重新插入到基因组中，遵循复制-切离-插入这一转座机制。Greco 等(2003)用这种方法研究了 Ds 的转座行为，分析表明在转化的早代 Ds 有很高的转座活性，T₀ 代有62％株系发生了转座，在 T₀ 代发生转座的株系中，92％的株系在 T₁ 代发生了转座。然而在 T₂ 代转座活性下降，仅有32％源于 T₁ 代转座的株系在 T₂ 代发生了新的转座。这可能是随着世代的增加转座活力有所下降：也可能由于 Ds 转座到基因组中较远的位置(例如转座到其他染色体上)，减数分裂时 Ac和Ds 分离到不同配子中，从而使 Ds 得以固定所致；此外也可能由于在晚代体细胞转座较多，没有传递到后代中。Chin 等(1999)也用第一种方法构建了 Ad/Ds 系统，研究表明近80％T₁ 代植株中的 Ds 从 T-DNA 的原始位点切除，表现出了很高的转座活性。在分蘖期剪去植株地上部分，通过培养其再生植株，发现有新的 Ds 转座，这说明同一植株在不同时期可能发生第二次转座。Ds 在转座过程中会发生结构上的重排，一个转化愈伤的再生植株上带有4个拷贝的 Ds 元件稳定地遗传给后代，克隆这4个 Ds 元件后分析其结构表明，有2个 Ds 在结构上是完整的，一个 Ds 有200 bp的缺失，一个 Ds 发生了 DNA 重排，有一个2.7 kb的插入(Izawa 等1997)。

　　第二种方法主要从 Ac和Ds 杂交后代分离群体中揭示 Ds 转座规律。本研究组前期研究结果表明 Ds 在水稻中的转座频率约为22.5％～25％，正反交组合中 Ds 元件转座频率基本一致(Zhu 等2003)：Kolesnik 等(2004)从25个 Ac和Ds 杂交组合产生的8720个 F₁ 植株的 F₂ 代中，发现4413个株系发生了可遗传的转座，各个株系转座频率的变幅为16％～72％，平均转座频率达51％，表现出很高的转座活性。在研究 Ds 的插入模式时，79％的转座至少有2个不同的插入，这可能是转座发生于不同的时期所致。Ito 等(2004)从10524个 F₂ 单株中检出了678个转座植株，它们来源于17个杂交组合的143个穗子，来源于相同植株的不同穗子的转座频率有差异，这可能也与转座时期有关。

　　上述两种方法在研究 Ac/Ds 的转座行为上各有优缺点。第一种方法不需要配制杂交组合，可以直接从转基因后代中获得转座突变体，节省了时间；但无法控制和区别插入是组织培养还是转座所致，给后代的转座分析造成困难。而且当转座位置较近时，Ac和Ds 可能表现连锁而使后代难以稳定。而第二种方法获得转基因植株后需配制杂交组合启动 Ds 转座，才能得到转座突变体。但用此方法获得转 Ac和Ds 植株后，应用分子检测得到单拷贝植抹后配制杂交组合，避免了多拷贝所造成的困难。而且通过杂交后代的分离可以使 Ds 转座突变体得以稳定。再者第二种方法可以利用亲本不断配置杂交组合获得大量转座个体，将避免高世代 Ac 转座酶可能的失活，对于大规模构建水稻饱和突变体库是有利的。

3.3　转座元件活性的恢复

　　用 Ac/Ds 系统构建插入突变体库时，Ac和Ds 的活性至关重要。有报告表明：在转化早代(T₀、T₁代)Ac转座酶具有较高的活性，而在T₂、T₃代其活性受到抑制而下降(Greco 等2003)。lzawa 等(1997)报告在有AcTPase基因存在时，13个F₄转座株系中仅1个株系具有转座活性，在其余株系中都没有检测到转座事件。这表明在世代传递过程中，转座元件活性可能会下降。Ac自主元什可以自发失活，McClintock 称之“change ofPhrase”，即 Ac 元件的失活是渐成的、可逆的(McClintock 1984)。这种现象常与转座子元件特异位点的甲基化有联系，DNA甲基化程度的提高会使 Ac 转座活性大大降低以至失活(Fedoroff和Chandler 1994；Brutnell和Dellaporta 1994；Schwartz和Dennis 1986)。现已有报告指出失活转座子可以被重新激活。在玉米组织培养过程中沉默的 Ac 元件被重新激活(Peschke 等1987；Brettell和Dennis 1991)。在水稻中，用组织培养的方法使得含有AcTPase活性和含有失活的 Ds 元件种子中的 Ds 元件重新获得活性而发生新的转座(Izawa 等1997；Ki 等2002)，而且不同培养时期，Ds 元件被激活程度不同(Ki 等2002)。用组培方法激活外源转座子在芸苔中也有成功的报告(Mckenzie 等2002)。这可能是在组织培养过程中发生了甲基化的DNA或氨基酸又脱去了甲基，使得转座子的活性又重新激活。但是组织培养过程中，从胚的培养到愈伤产生，再到组织的分化，发生了一系列了生理生化反应，在这些生理生化反应中究竟是否发生了去甲基化，还有待进一步实验证明和研究。

3.4　转座距离和转座热点问题

　　在拟南芥基因组中所鉴定的389个基因中，有209个基因与公共数据库中的预测基因有好的相似性(Bevan 等1998)，这说明54％的植物基因功能可以由公共数据库中的信息加以推断。水稻基因组全序列测序完成、公布及公共数据库中信息的积累和旁侧序列检测技术的进步使得转座子转座到基因中的频率得以估测。对于 Ac/Ds 的转座距离有两种观点的报道，一种认为 Ac/Ds 在插入位点附近转座，其转座的位置和原来的位置是连锁的(Jones 等1990；Bancroft和Dean 1993)。对拟南芥的研究报告，Ac/Ds 系统大约有50％的转座距离在600 kb以内．大约12％的转座距离在600～1000 kb之间(Smith 等1996；Machida 等1997)。这种转座规律对于 Ad/Ds 系统构建饱和插入突变体库提供了一种思路。吴瑞等(Garg 等2003)设想用 Ac/Ds 标签系统构建水稻接近饱和的非冗余的突变体库，其主要策略是：首先产生大约2000个含有Ds的T-DNA锚定系，相邻锚定系平均距离大约为200 kb，然后用这些锚定系和不同的Ac系杂交，产生新的转座亚系，选择相邻距离大约3 kb(基因平均大小为3 kb)的亚系，则只需大约150000个 Ds 插入植株就可以饱和整个水稻基因组。

　　另一种观点认为 Ac/Ds 转座是随机的，可以全基因组转座，转座的位置和其原来插入的位置是不一定连锁的(Sunderesan 等1995；Koprek 等2000)。是否存在转座热点一直是备受关注的问题。Hardeman和Chandler (1989)认为转座子元件插入某一位点的概率是不同的。Greco 等(2001)分析 Ac 插入位点的旁侧序列，有2/3旁侧序列表明与预测编码蛋白质的序列及EST序列相似。Greco 等(2003)分析67个 Ds 插入位点的旁侧序列，24％(16/67)的插入在基因转录区。Enoki 等(1999)检测出的99个旁侧序列中有21个与公共数据库中的已知基因相似。Kolesnik 等(2004)分析了2057个 Ds 旁侧序列表明在第4和第7染色体有插入的偏好性，在第7染色体的40 kb区段内有插入热点，有1/3的旁侧序列与水稻公共数据库中的蛋白质或 EST 序列同源。这都表明了 Ac/Ds 系统在水稻基因组中插入的频率是不均等的，己发表的文献反映出其插入到基因编码区中的频率较高，这对于水稻饱和突变体库的构建是一个障碍，但对于水稻基因功能的揭示是有利的。

4　Ac/Ds 系统所面临的挑战

　　Izawa 等(1991)首次引入水稻基因组中的 Ac/Ds 系统通过多年努力正日趋完善(Izawa 等1997；shimamoto 等1993；Enoki等1999；朱正歌等2001；Greco 等2001，2003；Kolesnik 等2004)。在理论上，利用 Ac/Ds 系统构建水稻插入突变体库以揭示新基因是较为理想的，然而实际中存在一些问题。十多年来，不同研究组利用 Ac/Ds 标签系统在水稻中仅克隆出2个基因，在拟南芥中克隆的基因最多，但也仅为6个(表1)。显然此效率远不能适应水稻功能基因组的研究。目前对出现这种状况的原因还很少研究。本研究组利用 Ac/Ds 系统产生了来自15个杂交组合的F₂代2000余株转座植株，利用Tail-PCR分析 Ds 元件的插入位置，发现虽然 Ds 元件确已插入到不少植株的基因当中，但转座植株仍然没有明显的突变表型(结果未发表)。近年来其他研究者也得出同样的结果(Greco 等2003；Kolesnik 等2004)。这一现象对水稻新基因的发现是一个很大的障碍，也是利用 Ac/Ds 标签系统研究水稻功能基因组的个瓶颈。出现这种状况的原因可能有以下几个：一是由于基因组中基因网络存在使该位点基因的功能通过其它支路得以实现。其二，一些转座元件插入到基因的内含子中，转座植株也不定会表现出突变性状。其三，转座元件插入到基因的外显子中，但因植物基因组中存在一些同源位点可以替代该基因的功能使得原有的代谢途径得到补偿，使得该基因所控制的表型性状未表现出预期的突变性状。其四，转座元件虽插入到基因的编码序列中，但其插入并没有改变基因的编码框，没有发生移码，或者转座元件的插入并没有改变编码此功能蛋白质的核心氨基酸序列。其五，一些基因只有在特定生理状态下或者经过特定的条件诱导才可能表现表型。这些都是造成转座元件插入后不出现突变表型的可能原因，也是反向遗传学研究中普遍存在的困难。近些年来，不同研究者把研究的重点放在改进 Ac和Ds 的转化载体的构建上，以期望能方便快捷地构建起用于功能基因组研究的插入突变体库，然而并没有注意到其中的困难。基于利用 Ac/Ds 标签系统研究水稻功能基因组所存在的瓶颈，探索利用 Ac/Ds 标签系统的新途径和有效检测突变的方法应该成为今后研究的重点，也是目前 Ac/Ds 标签系统用于水稻功能基因组研究的最大的挑战。

5　结束语

　　水稻基因组公共数据库庞大信息的积累为水稻功能基因组学研究提供了有利的条件，建立突变体库是研究功能基因组的个重要途径，然而这只是研究功能基因组学的第一步，以后还有更长的路要走。对于水稻基因组中所预测的32000～55000个基因，要利用突变体研究其功能就要建立饱和突变体库。按照Krysan 等(1999)建立饱和插入突变体库的公式P=1-(1-X/C)ⁿ，要获得概率(P)为99％，平均基因大小(X)为3 kb推算，则饱和水稻全基因组(C)需要突变体库的容量(n)为660000个突变体。要完成水稻饱和突变体库的构建将是一项宏伟的计划，需要投入大量的人力和财力。对于一个研究组来说要完成此计划需要很长的时间。为了尽早完成对水稻功能基因组中不同基因的注释及其了解不同基因间的相互作用及其表达调控，不同研究组的合作是必要的。

    注：
    （1）文章来源：植物生理与分子生物学学报，2005年31卷第5期；
    （2）作者单位：中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室。

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