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　　Bt(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性、需氧型芽孢杆菌，在其芽孢形成过程中，能产生一种以上的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，简称ICPs)。BT杀虫蛋白可分为α-外毒素、β-外毒素、σ-内毒素和虱因子，其中用于转基因植物的主要是σ-内毒素。σ-内毒素被敏感昆虫幼虫取食后，在其消化道内消化酶的作用下，蛋白被水解释放出约M_r 60×10³～70×10³的活性毒蛋白分子(toxin)。毒蛋白与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔。消化道细胞内的离子浓度和渗透压平衡遭到破坏，使上皮细胞裂解，最终导至昆虫死亡。20世纪80年代以来，Bt毒蛋白基因被先后转入棉花、玉米和马铃薯等植物中。Bt植物的问世，给害虫防治工作带来了一条崭新的途径。90年代中后期，Bt植物商业化种植面积迅猛发展。到2002年，全世界Bt作物种植面积已达1010×10⁴hm²；我国Bt作物主要以棉花为主，1997年开始种植，到2002年已占华北地区植棉面积的90％以上。

　　转基因植物给人类带来巨大利益的同时，随之而来的生态风险问题倍受关注，大量研究主要集中于转基因作物与近源物种之间的基因流、靶标害虫抗性、对非靶标生物的影响等。由于转Bt作物的长期种植可能会使Bt毒素在土壤中残留、富集。而土壤生态系统是生物物质循环和能量转化过程的重要场所，Bt杀虫蛋白在土壤的富集很可能影响土壤的特异生物功能类群以及土壤生物多样性。因此，Bt毒素在土壤中的残留及其对土壤生态系统的影响近年来逐渐受到国内外广泛关注。本文综述了Bt毒素在土壤中残留动态的研究进展，旨为开展这方面工作和系统评价转基因作物的环境风险提供参考依据。

1　土壤中Bt毒蛋白的测定方法

　　传统上，对混合蛋白中的目标蛋白进行检测和定量分析通常使用的是SDS-PAGE电泳结合Western印迹分析法，这当然也适用于Bt毒蛋白的检测，但是该方法操作复杂。灵敏度不够，而土壤中Bt毒蛋白的舍量通常很低，且释放到土壤中的Bt毒素很快与土壤微粒紧密吸附结合，所以很难用以上两种方法检测到土壤中的Bt毒素。酶联免疫测定法(enzyme linkedimmunsorbsent assay，ELISA)是20世纪80年代初利用抗原抗体特异性结合以及酶法测定原理建立起来的免役学技术，操作简单、快速，灵敏度强，检测极限高。鉴于该技术高灵敏度的优点，国外在上世纪初就把这种方法用于土壤中Bt毒素的测定。1995年，Tapp 等用该方法测定上壤中的Btk(Bacillusthuringiensis subsp. kurstak)毒素，灵敏度达每克土壤中含3 ngBt毒素的最低极限。但也有研究表明，Bt毒蛋白进入土壤后就会迅速地被具有表面活性的土壤颗粒吸附并紧密结合，由于没有很好的方法将它们提取出来，这部分蛋白用ELISA法难以检测。而Bt蛋白与上壤颗粒紧密结合后。它仍对敏感昆虫县有毒性，传统的生物测定技术被用于研究土壤中Bt毒素的残留Sims等和Zwahleh等用烟蚜夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)和玉米螟(Ostrinia nubilalis Hubner)做试虫分别研究了上壤中Btk毒素的降解以及在土壤环境条件下转基因玉米组织中Btk毒素的降解动态。Tapp 等用烟草天蛾(Mandua sexta)做试虫，研究了Btk毒素的降解与土壤矿物质理化特性的关系。生物测定技术也有自身的缺点，首先是操作复杂且受到试虫的影响；其次，土壤中的成分很复杂，除了Bt毒蛋白对供试昆虫有毒性外，很可能还有其它的对试虫有毒性的成份，这些因素都会影响测定的结果。所以，把两种研究方法结合起来，优势互补，研究结果将会更为科学。

2　Bt 蛋白在土壤中的残留与降解

2.1　农田土壤中Bt毒蛋白的来源和累积

　　农业生产实践中利用 Bt 主要有两种途径：即直接喷洒 Bt 制剂或种植 Bt 植物。Bt 制剂通常是由 Bt 细胞、孢子和晶体蛋白的混合物组成，在农业生产中已经有长期的使用历史，被认为是对生态环境比较安全的生物杀虫剂。许多研究者认为，因为 Bt 不能在自然生境如土壤中存活、生长，产生的孢子很快会被紫外线钝化，因此不会或有极少 Bt 毒素残留于自然环境中。大面积种植转 Bt 基因作物后，转 Bt 作物在生长期可持续通过根部向土壤中分泌 Bt 蛋白。另外，含 Bt 毒素的植株表面残体脱落物、植株伤口流出物、木质部流体以及花粉等都会释放到土壤，造成 Bt 蛋白在土壤中累积的可能特别是作物收获后，大量 Bt 蛋白随植株残体留在土壤中。这些 Bt 毒素在土壤中能否长期残留并累积主要依赖 Bt 毒素浓度的增加速率、微生物降解速率和非生物因素的钝化速率等因素的作用：当 Bt 作物向土壤中释放的 Bt 毒素的量超过了靶标生物的消耗、微生物的降解和非生物因素的钝化时。Bt 毒素就会在自然界中残留、浓缩和累积，进而危害非靶标生物，并会提高靶标生物的抗性选择压。而且研究还表明，当这些额外毒素进入土壤后，通过与具有表面活性的土壤微粒结合抑制了土壤微生物的降解，造成 Bt 毒素在土壤中长期存在并富集。与土壤微粒结合后的 Btk 毒素和 Btt (Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis)毒素抑制土壤微生物的降解过程可能是导致 Bt 毒素存土壤中持续残留的重要原因。因为游离状态下的 Btk 和 Btt 毒素不管是在水培营养液中还是在土壤中，很容易被单一或混合微生物群体做为碳、氮资源而利用。然而，与土壤中具有表面活性的微粒结合后，Bt 毒素就不能被土壤微生物作为碳资源，仅轻微地可作为氮资源利用。

　　如 Saxena 等通过无菌水培、灭菌土培和非灭菌土培3种不同的方式种植转 Bt 基因玉米 NK4640BT 。通过 SDS-PAGE 电泳、免疫检测和生物测定，在3种方式种植的玉米根部都发现了 Cry1Ab 毒蛋白。而25 d后，当水培营养液有细菌存在时，用同样3种检测法都没有测到 Cry1Ab 毒蛋白的存在；而两种土培玉米根部依然发现存在 Cry1Ab 毒蛋白。这进一步证明了转 Bt 玉米根系向土壤中持续分泌 Bt 蛋白，游离的 Bt 蛋白易于被微生物降解，但是 Bt 蛋白与土壤中特定成分发生结合后，就大大减缓了土壤微生物和非生物因素对Bt蛋白的降解。

2.2　Bt 毒蛋白在土壤中的降解及持续时间

　　Bt 毒素与土壤微粒的紧密结合大大延长了其在土壤中的存留时间。Palm 等将转 Bt棉花叶枝埋入5种不同的微生态系统土壤中，发现140 d后在3种土壤中仍能检测到 Bt 毒素，含量分别是起始浓度的3％、16％和35％。James 等报道， Bt 毒素与土壤粘粒结合后，毒性可以持续2-3 mo。另外，Saxena 等报道，通过转基因玉米根部分泌和残体降解释放到土壤中的 Bt 毒素在土壤中滞留期最长可达350 d。一些研究者把纯毒蛋白加到土壤中的研究显示，毒蛋白可在土壤中残留234 d以上。Sims 等用生测方法检测了 Bt 玉米收获后，根茬中的杀虫蛋白的滞留时间，结果发现杀虫蛋白在1447 d后才消失 Zwahlen 等把传粉期的转基因玉米组织埋入土壤，200 d后仍然可以检测到Bt蛋白。

　　但也有一些试验证明， Bt 毒蛋白在土壤中能很快降解。Head 等用 ELISA 和生物测定方法对多年种植 Bt 棉的土壤进行了测定，Cry1Ac 毒蛋白残留量极低以至无法测出；Hermand 等对 Cry1F 杀虫晶体蛋白在土壤中的降解速度进行了生物测定，结论是 Cry1F 毒蛋白在土壤中的降解也很迅速。半降解时间仅需要0.6 d，90％的降解只需要6.9 d。

　　不同的研究者得出差异很大的结果，一般认为是因为以下5个主要因素的不统一造成的：i) Bt 毒蛋白的种类；ii) Bt 毒蛋白的形式(孢子和晶体)；iii)土壤类型和土壤湿度；iv)土壤中毒蛋白浓度；v) 生测试虫的敏感性程度。因此，不能简单地将不同研究条件下所得的结果加以比较，规范的研究方法对明确 Bt 蛋白在土壤中残留和降解规律是致关重要的。

3　Bt 毒素与土壤微粒的吸附和结合规律

　　如上所述， Bt 毒素进入土壤，不只是以简单的游离形式存在，更多的是与具有表面活性的土壤微粒吸附并发生紧密结合。

3.1　Bt 毒素与土壤粘土矿物的吸附和结合

　　Bt 毒素与土壤粘土矿物的结台能力与土壤的理化特性以及毒素的结构有关。Venkateswerlu 等研究了纯化 Bt 毒素与土壤矿物质蒙脱石(montmorillonite)和高岭石(kaolinite)的结合情况，发现 Btk 毒素和前毒素能迅速地吸附到两种矿物质上，30 min 就能吸附70％以上的 Bt 毒素，6 h后达到吸附平衡。蒙脱石的吸附作用明显高于高岭石，二者最大吸附量分别是790 μg/mg 和280 μg/mg，分别占加入毒素量的38％和13.5％。 Bt 毒素与土壤中具有表面活性的微粒的吸附量与土壤的酸碱度有很大的关系。PH 在4.4到10.0范围内时，蒙脱石对毒素的吸附量随 PH 的增加而线性降低；高岭石的吸附量也随 PH 的增加而降低，但其最大吸附量与调节 PH 的缓冲液的离子类型和悬浮基的强度相关。Tapp 等报道， Btk 和 Btt 毒素与土壤粘土矿物的吸附在 PH=6 时达到最大值，这是因为 Bt 毒素的等电点在5.5左右，当土壤的 PH 值接近毒素蛋白的等电点时，中性的毒素蛋白所受的斥力最小，致使毒素蛋白与土壤表面有最大的接触饥会，而提高了毒素与土壤微粒的吸附水平。结合到高岭石的毒素可被 ddH₂O 和0.2％的 NaCO₃ 溶液解吸附，而结合在蒙脱石上的 Bt 毒素只能被0.2％ Tris 缓冲液解吸附。

　　Bt 毒素与土壤微粒的结合与毒素的结构也有很大的关系，Btt 和 Btk 毒素的分子量相差无几，而Btt毒素渗入蒙脱石和吸附及结合到蒙脱石和高岭石的能力都低于 Btk 毒素。X射线衍射分析发现：Btt 和 Btk 可部分地嵌入蒙脱石，Btt 毒素嵌入较深，而两种毒素只能附着在高岭石上，不能嵌入。结合到土壤微粒中的 Btt 和 Btk 毒素可用生测、斑点印迹ELISA(dot-blot ELISA)和流式细胞光度法(flow cytometry)检测到。

3.2　Bt 毒素与土壤腐殖酸的吸附和结合

　　Stotzky等把纯化 Btk 毒素加到从不同类型的土壤中提取的腐殖酸中，结果显示，Btk 毒素在腐殖酸中的游离状态时间很短，很快就与腐殖酸发生结合。森林土壤腐殖酸与耕作土壤腐殖酸达到吸附平衡的时间分别是 1～2 h和 4～8 h。Bt 毒素的浓度一定时，吸附量与腐殖酸的含量成正比；当腐殖酸的含量一定时，腐殖酸的吸附量与 Bt 毒素的浓度成正比。Bt 毒素与土壤微粒的结合非常紧密，吸附到土壤微粒上的 Btk 和 Btt 毒素用蒸馏水冲洗两次，仅分别有原吸附量的10％和30％被解吸下来。实验表明，腐殖酸对 Bt 毒素的吸附能力与其理化特性有关：酸度较高和酚基含量高的腐殖酸吸附能力较高，羟基的含量和聚合作用的强度与其吸附能力无关。

　　不少专家也对 Bt 蛋白与土壤中粉粒、沙粒和泥沙粒大小尺寸的土壤微粒的吸附作了研究，发现Bt毒素不能吸附到沙粒和泥沙粒上，这是因为土壤中的粉粒、沙粒和泥沙粒不具有表面活性的缘故。

4　土壤中 Bt 毒素的杀虫活性

　　转基因作物释放的毒素进入生态系统后是否能保持活性，是评价转基因作物对土壤生态系统影响的重要指标。研究证明：当Bt毒素与土壤中具有表面活性的微粒结合后，可降低土壤微生物对其的敏感程度并抑制微生物的降解，但并没有改变 Bt 毒素的结构，所以与土壤中具活性表面的微粒结合后的 Bt 毒素蛋白保持甚至加强了其杀虫活性。例如，结合到土壤矿物质蒙脱石、高岭石和土壤粘粒的 Btk 和 Btt 毒素能保持其对烟草天蛾幼虫(Menduca sexta)和科罗拉多马铃薯甲虫幼虫(Leptinotarsa decemlineata)的毒力。Crecchio 等把 Btk 毒素加入到腐殖酸中，Btk 毒素可迅速紧密结合到腐殖酸上并抑制土壤微生物的降解和保持对鳞翅目幼虫的杀虫活性。水培和土培转 Bt 基因玉米的根系分泌物中均发现了活性的 Bt 毒素，田间试验与秸杆分解试验证实土壤中根系分泌物和秸杆释放的 Bt 毒素仍具有杀虫活性。Bt 毒素与粘土和有机质结合时，ELISA检测不到，但生测证明其活性可持续25 d。Tapp 等把纯化 Btk 毒素加入没有灭菌的土壤中的模拟实验证实，其杀虫活性至少可以保持234 d。

　　研究还表明：与土壤中粘粒结合的 Bt 毒素蛋白的杀虫活性高于游离态毒素。可见 Bt 毒素与土壤具表面活性颗粒的结合不但阻碍了土壤微生物的降解，且使毒素蛋白在其颗粒上富集了。结合态 Bt 毒素的活性持续时间与粘粒含量呈正比，而与土壤 PH 值成反比。如 Bt 毒素在自然含有或人为加入高岭石土壤中的杀虫活性比自然含有或人为加入蒙脱石的土壤高，且持续的时间长，其主要原因是含蒙脱石的土壤 PH 值高和细菌的活性强。中性土壤中转 Bt 基因棉花和玉米 Bt 毒素的活性降低较快，120 d下降到17％～23％。Bt 毒素的杀虫活性与土壤含水量无关，表明 Bt 毒素的活性在有氧或无氧条件下无差别。

5　展望

　　目前的研究已表明，转 Bt 基因作物通过不同形式向土壤中释放的 Bt 毒素可被土壤中具有表面活性的颗粒吸附并紧密结合，抑制了土壤微生物的降解，致使 Bt 毒素蛋白在土壤中长期滞留甚至富集。由于与土壤颗粒结合后的 Bt 毒素蛋白结构并没有改变，依然保持其杀虫活性。Bt 毒素在土壤中的残留可能会对土壤中非靶标生物造成不良影响，成为影响土壤生态系统的一个重要因素。因此转基因植物在进入田间释放和商业化应用的过程中应该开展土壤生态学影响的研究和监测上作。相对而言，发达国家在这方面已开展了不少工作，但由于研究方法和试验条件的限制，许多问题仍不清楚。Bt 作物环境影响的研究是一个长期而复杂的过程，从不同的角度开展系统的研究工作，为系统评价转 Bt 基因作物释放可能引起的生态环境风险提供理论依据十分紧迫。

    注：
    （1）文章来源：应用与环境生物学报，2005年　第４期；
    （2）作者单位：中国农业科学院植物保护研究所　等。

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