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　　水稻(Oryza sativa L.)是世界上消费人口最多的粮食作物之一。随着人口持续增长，耕地不断减少以及人类生活质量的提高，提高水稻的产量和质量显得尤为重要。长期以来育种家们主要利用栽培稻内的基因资源在二倍体水平上做工作。在当前栽培稻基因资源相对缺乏，超级稻育种任务艰巨的情况下，充分利用具有丰富遗传多样性的野生稻已成为水稻育种的一个突破口，野生稻遗传资源的研究日益受到重视。野生稻是一个丰富的优良基因宝库，在21个野生稻物种中已经鉴定出的优良性状有20多个。主要包括胞质雄性不育性、强节间伸长能力、早熟、优质大粒、大花药、长柱头、柱头外露、高产量、高蛋白含量等等。而且野生稻也是丰富的抗稻病虫的资源和强抗逆性材料的资源。稻属中的虫害如褐飞虱、白背飞虱、黑尾叶蝉、稻蓟马、螟虫、稻水蝇等均可以在野生稻中找到抗源。常见病害如草丛矮缩病、白叶枯病、稻瘟病、黄矮病、纹枯病、细菌性条斑病等也能在野生稻中找到相应的抗源。从作物进化的角度看，异源基因组结合和多倍体化体现了作物进化的大方向。小麦、棉花、油菜等都经历了从二倍体向异源多倍体进化的道路。水稻是二倍体，基因组小，增加基因组数，提高倍性水平，同时针对同源四倍体水稻结实率低的问题，采取拉大亲缘关系距离、减少多价体的形成，利用广亲和、无融合生殖、 Ph 基因等特殊基因，从遗传机理上提高多倍体水稻的结实率。笔者主要借鉴已有的研究经验和教训，综述了应用现代生物技术解决利用非 A 基因组野生稻优良基因组合的困难，并探讨了水稻育种的有效途径。

1　稻属远缘杂交的研究

　　稻的远缘杂交从广义上包括野生稻与栽培稻种间、栽培稻种间、亚洲栽培稻籼粳亚种间甚至不同生态型品种之间的杂交。从狭义上讲，它指的是栽培稻与野生稻( A 基因组和非 A 基因组)之间的杂交。本文主要针对非 A 基因组的野生稻和栽培稻杂交来谈论存在的问题及解决办法。在生物进化上，种间杂交是新种形成的一个重要途径。栽培小麦(Triticumaestivum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、甘蓝型油菜(Brassica napus)等重要农作物都是经过自然杂交产生的，再经长期自然选择和人工选育而形成拥有丰富品种类型的异源多倍体新物种。稻属中通过远缘杂交获得野生稻有利基因的障碍主要是由于野生稻染色体组型与栽培稻的染色体组型不同而造成的。目前稻属23个种已经被确定染色体组型的有19个种。野生稻分别属于A、B、C、D、E、F、G、H、J、K 等10大基因组，由这10种基因组组成了 AA、BB、CC、BBCC、CCDD、EE、FF、GG、HHJJ、HHKK 等10种染色体组型。两种栽培稻都属于 AA 染色体组型。栽培稻与非 A 基因组的野生稻进行杂交比栽培稻与 A 基因组的野生稻杂交要困难得多。虽然迄今为止42个涉及到 AA×BB、AA×BBCC、AA×CC、AA×CCDD、AA×EE、AA×FF及AA×GG 等17种染色体组组合形式的异源种间杂种曾被获得，但这些组合的杂种 F₁ 自交均不结实。远缘杂交的困难主要表现在栽培稻和野生稻杂交不亲和、杂交后杂种胚败育以及连锁和长期分离等方面。针对杂交不亲和，可以采用激素处理雌蕊和授粉后药物喷穗的办法克服，而胚败育则主要通过胚挽救的方法解决，尤其是通过原生质体融合不仅直接完成亲本的核遗传重组，而且也实现了细胞质的融合，有利于克服核质不亲和的问题。对杂种 F₁ 的育性(不育或育性极低)问题主要寄希望于多倍体化和组织培养(幼穗培养、花药培养)选择体细胞变异等方法，从而达到转移野生稻基因获得能稳定遗传的优良性状的目的。

　　野生稻基因转移最通常的一条途径是采用常规远缘杂交和连续回交选择的基因渐渗(gene introgression)方法。相同染色体组的种间杂交相对比较容易；异源染色体组间的远缘种杂交则因杂种胚的胚乳发育不良而导致幼胚停止发育。胚挽救技术是常规远缘杂交后针对幼胚死亡等现象而采用的一种幼胚离体培养技术。我们用温汤去雄法或人工去雄法将母本(多为栽培稻)去雄后，再授以开花盛期的野生稻花粉。授粉后 7～14 d 取出未成熟杂种胚，培养在添加低浓度生长素和细胞分裂素的 N6 培养基中，则可以获得正常的 F₁ 植株。颜辉煌等以远缘杂交与胚挽救技术相结合的方式已把紧穗野生稻(O.eichingeri，CC)的褐飞虱抗性、小粒野生稻(O.minuta，BBCC)的稻瘟病和白叶枯病抗性等成功地转移到了栽培稻中。

　　水稻幼穗是体细胞培养和原生质体培养中广泛应用的外植体。根据水稻远缘杂种在离体培养条件下，体细胞染色体数目和结构不太稳定，容易产生变异的特性，不育的栽培稻野生稻杂种的幼穗经离体培养极有可能产生大的变异。这样对于克服 F₁ 代出现的杂种不育性有很重要的意义。栽培稻与阔叶野生稻的不育杂种 F₁ 幼穗诱导产生愈伤组织，经多次继代培养后，再生植株可育并结实，且其性状介于双亲之间，表明不育杂种经过离体培养产生的变异有可能改变杂种的育性。另外，研究证明超低温贮藏愈伤组织有可能提高野生稻体外培养细胞的某些特性。

　　细胞融合技术可克服有性杂交不亲和的障碍，并能使双方细胞的核和质都得以融合，这是其他方法所不能达到的。尤其是细胞融合中电融合技术越来越成熟，更加推动着稻属种间杂种形成与进化育种的进展。

　　外源 DNA 直接导入受体作物的方法能弥补常规育种和植物基因工程高新技术的不足，不失为一种分子育种的简易途径。通常采用子房注射法、切柱头涂抹法和液滴法(或微注射法)。液滴法比前两种方法雌蕊成活率高，因处于受精前后的卵或合子细胞都具有不完全细胞壁的天然原生质体状态，从而易被外源 DNA 转化。

　　建立外源基因的分子标记有利于辅助选择育种。打破远缘杂交后代因亲本染色体亲缘关系远所具有的减数分裂不正常现象，如当野生稻和栽培稻的染色体片段发生重组时，野生稻有利基因和不利基因的连锁就很难被打破。李容柏对野生稻和栽培稻杂种的9个性状比较后发现，野栽杂种的生长习性、落粒性、小穗育性及粒型等9个性状大多数表现出以野生稻性状为主，说明野生性状的传递力强，对后代影响大。这样必然会阻碍杂种后代在育种中的利用。采用多代回交淘汰及在较大杂种后代群体中反复筛选不仅费时费力，而且效果也不一定理想。此时外源基因的分子标记的建立则不失为一个良好方法，它能准确选择出只带有外源目的基因的重组体。打破连锁障碍从而克服野生稻基因转移和利用过程中的困难以提高杂种后代的可利用性。

2　稻属异源多倍体化的研究进展

　　蔡得田等提出了利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻的三步走战略：①选用极端籼稻(O.sativa subsp.indica)、粳稻(O.sattva.subsp.japonica)、爪哇稻(O.javanica)杂交，诱导亚种间杂种多倍体。②诱导亚洲稻(O.sativa L.)与非洲栽培稻(O.glaberrima)和野生稻( A 基因组)种间杂种多倍体。③诱导 A 基因组的栽培稻与其他不同基因组野生稻的基因组间杂种多倍体。三步走战略的第二、三步即用远缘杂交和多倍体化相结合以获得理想的异源多倍体种间杂种和基因组间杂种。在实施过程中要注意发挥一些基因材料，如用无融合生殖、广亲和与 Ph 基因的特殊作用，为选育异源多倍体水稻提供可靠的保证。

　　采用异源多倍体化来克服因远缘杂交带来的缺少成对染色体配对而导致的杂种不育问题以获得稳定的优良水稻品种。在高等植物中，杂种不育一般有三类：染色体不育(chromosomal sterility)，基因不育(genic sterility 和细胞质不育(cytoplasmic sterility)。种间杂种的不育性主要是染色体不育和单倍体基因组不育引起的。一般情况下不易区分不育的类型，但染色体加倍技术将会使染色体不育和单倍体基因组不育得以避免。更确切地说，就是要在育种中获得不同基因组的异源多倍体。我们采用的人工方法主要是将栽培稻与非 A 基因组的野生稻杂种 F₁ 代通过秋水仙素处理愈伤组织或丛生芽进行染色体加倍而形成异源多倍体(见发明专利 ZL01133528.7)。

　　在自然界中双二倍体化是植物克服染色体不育和单倍体组不育的主要途径，其机理对作物遗传育种具有重要的理论与实际价值。双二倍体即异源多倍体，其来源有两种情况：①异源杂种二倍体分生组织细胞的有丝分裂紊乱造成了染色体数目的加倍，该情况多为人工控制。②杂种在减数分裂过程中产生的未减数配子受精融合后形成，这多在自然条件下发生。但杨继研究发现杂种性能促进未减数配子的形成。具有生殖障碍的二倍体种问杂交的直接产物一般是不育的，其减数分裂不正常，种间杂种产生的配子中往往是未减数的二倍性配子具有功能，从而能发生交配，并产生能育的后代，形成双二倍体种。野生稻与栽培稻杂种当代染色体丢失现象并不多见，所以利用染色体加倍的种间杂交或对远缘杂种 F₁ 行加倍处理，可以获得双二倍体，已知稻属的14种双二倍体都是通过这种方式获得的(表1)。异源多倍体化提高了基因组间杂种的花粉育性和结实率，但仍有3个组合是完全不结实的，说明核质亲和性对育性起重要作用(图1)。在被子植物中大约有 70％的植物是异源多倍体。异源多倍体具有固定杂合性 (fixed heterozygosity) 的能力，因为它所带有的祖种基因已经通过多倍化固定在多倍体种内，在随后的世代中不会剧烈分离和重组，这正是远缘二倍体杂种所不能达到的稳定遗传。异源多倍体化不但克服了远缘杂交带来的杂种不育，而且带来基因组间的杂合性，增大了基因组容量，使遗传变异范围变得更广，能增强对不利因素影响的耐受力，从而带来高产和稳产的根本变化。普通小麦、甘蓝型油菜以及陆地棉和海岛棉 (Gossypium barbadense) 这些异源多倍体作物在产量和遗传上具有的进化历程对于水稻异源多倍体育种是一个启示。

3　远缘杂种的分析鉴定

　　种间杂种传统的鉴定方法是对其 F₁ 代植株的花粉育性、结实性、形态特征、花粉母细胞减数分裂行为以及其他的一些细胞学研究进行全面分析，从而鉴定杂种的真实性。在细胞学研究中分析远缘杂种减数分裂期形成的二价体比例是分析种间亲缘关系的一种经典的细胞遗传学方法。

　　同工酶是经典的生化遗传标记。同工酶是基因的表现，酶谱代表着基因型。通过分析酶谱能比较可靠地了解种的遗传组成，另因其易于检测，常用于鉴定种间、属间杂种。同时用几种同工酶来鉴定会提高鉴定杂种的真实性和准确性。酶电泳技术鉴定杂种有许多的优点。在用等位酶方面的资料推断杂种的优点评述中，其中最大的好处在于受等位基因编码的等位酶通常都以共显性方式遗传，这样根据待定亲本中等位基因的种类和频率及其在杂种中的分布和组合，便能够作出正确的推断。验证异源多倍体与杂种的鉴定上用等位酶方法是相类似的。

　　随着分子生物学的发展，分子生物技术 (RFLP、RAPD、AFLP、SSR、原位杂交技术等) 已成功地应用于野生稻杂种的鉴定、后代遗传组成的分析、外源 DNA 片段及其大小的检测、野生稻基因的标记定位和克隆，野生稻资源及其杂种的鉴定分类、起源、亲缘关系及进化关系等研究。基因组原位杂交 (Genome in situ hybridization，GISH) 以其快、准、直观地鉴定出外源染色体或染色体的片段的优点而成为鉴定外源遗传物质极为有效的手段，在对水稻远缘杂种的外源染色质鉴定中已显示出明显的优势。把 BAC-FISH (BAC 克隆与荧光原位杂交结合)技术应用于野生稻，覃瑞等首次利用 BAC 克隆在水稻远缘物种中寻找相应的抗性基因并确定其物理位置。利用分子标记和芯片技术鉴定异源杂种和异源多倍体，分析它们后代的遗传和生理特性，发掘野生稻的优良基因都将成为今后研究的重要方向。

4　结束语

　　远缘杂交和多倍体化相结合的育种技术不仅在理论上已经日臻完善，而且继亚洲栽培稻基因图谱公布后，美国正以野生稻为重点开展稻属11个基因组图谱研究。其结果将为异源多倍体水稻研究开创更好的理论基础条件。从国内外开展的相关工作，尤其是我们在栽培稻亚种间、栽培稻野生稻种问和基因组间杂种多倍体的创造和在克服远缘杂交不亲和性、杂种 F₁ 不育性以及选育异源多倍体水稻等方面取得重要进展后，又获得具高结实率的多倍体种间组合、具较高结实率和不落粒优势的栽野杂种多倍体株系，以及不同基因组间杂种多倍体群体的新结果，初步说明远缘杂交结合多倍体化技术在稻属育种中的应用必将成为选育超级稻的一个新途径。

    注：
    （1）文章来源：武汉植物学研究，2005年23卷第5期；
    （2）作者单位：烟台师范学院生命科学院等。

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