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　　黑色素 (melanin) 是一类广泛存在于动植物和微生物体内的非均质的类多酚聚合体，按其合成底物和中间产物的不同可将黑色素分成不同的类别。不同种类黑色素的性质和作用具有很大的相似性，红外光谱扫描图中具有特征吸收峰。研究表明，黑色素与许多以机械力侵入寄主的病原菌致病能力密切相关，缺乏黑色素生成的突变菌株因缺乏足够的膨压而丧失致病能力。黑色素除在病原真菌侵入寄主过程中起作用外，还能赋予生物体某些特殊防御作用，如外表修饰、抗辐射、抗氧化、清除自由基等多种功能。

1 黑色素的种类及生物合成

　　经对生物体中黑色素合成途径进行的研究表明，黑色素按其中间产物可分为4种：γ-谷氨酰胺酰-3，4-对苯二酚 (GDBH)，儿茶酚，多巴 (DOPA)，二羟萘 (DHN)。 DOPA 黑色素以酪氨酸为底物，在酪氨酸酶作用下启动一系列生化反应，最终合成黑色素。DHN 黑色素在子囊菌亚门和半知菌亚门真菌中广泛存在，醋酸盐在 alb1 基因产物多聚酮 (polyketide) 合成酶的作用下合成羟萘 (4HN)，通过 NADH 作用还原成 scytalone (SCY)，再在 SCY 脱水酶(由 rsy1 基因编码产物)作用下脱水转化成三羟萘 (3HN)，然后在 buf1 基因所编码的酶产物作用下，即依赖于 NADPH 脱氢酶，以 3HN 为底物还原成 Vermelone (VER)，VER 经脱水成二羟萘，最后合成多聚二羟黑色素。PDA 培养基中添加淡黄霉素和 scytalone (生成 DHN 黑色素的两种主要的中间物质)，培养缺乏产 DHN 黑色素的白化突变菌株，该突变株能够恢复产黑色素的能力，菌落成黑色。

　　DOPA 黑色素合成过程如图。

　　人们对黑色素形成的有关酶基因研究十分关注。Chumhey 和 Valent 采用突变体分离到 alb1、rsy1 和 buf1 3个基因，它们编码的二羟萘酚 (DHN) -黑色素合成酶对合成 DHN 黑色素起着关键作用，丧失上述任何一个基因，都会使黑色素形成的能力丧失。

　　我们在研究中发现，玉米大斑病菌菌株 01-23 与菌株 01-24 的黑色素红外光谱图一致，但与乌贼墨汁黑色素(具有 DOPA 黑色素特性)有差异。乌贼墨汁黑色素：3,300～3,400 cm^-1 吸收峰为吲哚的 NH 伸缩振动峰；1,600～1,620 cm^-1 附近强吸收峰(特征吸收峰)为 C=C 的伸缩振动峰。玉米大斑病菌黑色素：3,400 cm^-1 处吸收峰为聚合体中-OH 吸收峰，2,900～2,930 cm^-1 强吸收峰，2,810～2,860 cm^-1 和1,450～1,460 cm^-1 处吸收峰为脂肪族 C-H 伸缩振动峰，1,700～1,980 cm^-1 的弱吸收峰代表芳香环振动峰，与文献报道的 DHN 黑色素吸收峰一致。而 GDBH 黑色素在1,100 cm^-1 处有特征峰。在培养玉米大斑病菌的 PDA 培养基中加入浓度为 10 μg/mL 的三环唑(专一抑制 DHN 黑色素形成)，能够有效的抑制玉米大斑病菌黑色素生成。说明玉米大斑病菌黑色素的合成属于 DHN 途径。

2 黑色素的性质

　　黑色素 (melanin) 在细菌、真菌及动植物体内均能产生，属高分子量的化合物，为非均质的类多酚聚合体，扫描电镜下观察其结构为无定形小颗粒(图1)。

　　微生物所产生的黑色素主要分为胞内和胞外黑色素。当前，研究微生物胞外分泌黑色素的报道比较多。彭方等从土壤中筛选得到一株产黑色素能力高、快而且产量大的 T1 菌株。段晓红等用固定化细胞方法固定产酪氨酸酶的细菌，以酪氨酸为底物生产黑色素获得成功。

　　本实验室对玉米大斑病菌胞内黑色素进行理化性质研究时发现，玉米大斑病菌黑色素与 Sigma 公司生产的乌贼墨汁黑色素、酪氨酸人工合成黑色素 (DOPA) 具有相近的理化性质，见表1。

3 DHN 黑色素与病原菌致病性的关系

　　植物病原真菌能够成功侵入寄主组织并在寄主组织中生长繁殖是其致病的基本条件，生物间经过长期的协同进化，形成了多样而复杂的互作机制。许多真菌可以形成明显的有黑色素的侵染细胞，其侵染寄主的机制以直接机械侵入为主，细胞壁降解酶对细胞的软化作用为辅。

　　许多真菌黑色素由多聚二羟萘 (DHN) 所组成，它是戊二酮生物合成途径的末端产物。研究表明，对于许多植物病原真菌来讲，DHN 黑色素都被认为是重要的毒力因子，因为已经黑色素化的附着胞外壁可以使病菌积累足够的膨压穿透寄主细胞。在孢子侵入前，大量的黑色素沉积在附着胞细胞壁的内层，形成一黑色素层(图2)，使细胞壁上的孔径小于1 nm，仅允许水分子等小分子物质通过．而甘油等有机分子不能透过细胞壁，防止了形成膨压的溶质渗透到细胞外，产生很大的机械压力，这在梨黑星病菌 (Venturia inaequalis) 和大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 中均有报导。附着胞其小孔与基物表面相接触使得小孔成为病菌与基物进行大量的物质信息交流的窗口，这种状况对以后附着胞侵染寄主，与寄主建立寄生关系是极为重要的。对于以机械力侵染寄主组织的病原菌来说，没有黑色素就没有正常附着胞，黑色素缺乏的突变菌株附着胞缺少足够的膨压侵入寄主的表皮，即附着胞就会丧失侵入能力，最终使得病原菌丧失致病性。因此产生黑色素是病菌具有致病性和侵入寄主的前提。

　　许多真菌，如稻瘟病菌 (Pyricularia oryzae) 和瓜类炭疽病菌 (Colletotrichum orbiculare) 侵染时产生的附着器必须经黑色素化才具有侵染能力；禾谷炭疽病菌也产生与稻瘟病菌相似的黑色素附着胞，Bechinger 等测量了禾谷炭疽病菌侵入栓产生的压力，禾谷炭疽菌附着胞的直径约为 7 μm～9 μm，而穿透植物表皮的侵染栓仅有 2 μm。Chida 和 Sisler 在1987就确定了稻瘟病菌黑色素缺乏的突变菌株因缺乏足够的机械力而不能穿透寄主组织；Hignett 和 Kirkham 证实了黑色素与苹果黑星病菌在苹果组织中的侵入和生长密切相关；Smereka 等人在研究苹果黑星病菌与苹果叶片组织相互作用的过程中发现在病菌附着胞壁中积累着一层黑色素。Kim 等近期研究发现黑色素可以加固细胞壁，提高分生孢子和菌丝对寄主免疫系统的抵抗力，增强了病原菌的侵染能力。

4 黑色素的作用

　　黑色素不仅与真菌致病力密切相关，保证病原菌附着胞产生足够的膨压穿透寄主组织，还能作为紫外线吸收剂、抗氧化剂和新型天然药物载体，是目前所知的唯一保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体。黑色素已被用作苏云金芽孢杆菌 (Bt)光保护剂，使其免受阳光紫外线的损害，延长杀虫时效。最近研究发现，黑色素能有效地清除活性氧自由基，保护生物大分子如 DNA 免受氧化损伤。黑色素对菌丝的生长和繁殖不起作用，但它可以加强真菌在不良环境条件下的生存和竞争能力，保护微生物免受紫外线和溶菌酶等的作用，与真菌的抗逆性、缓冲外界逆境(温度过高过低、光线过强过弱等)对细胞的伤害有关。

5 DHN 黑色素合成的抑制因子

　　alb1、rsy1 和 buf1 基因编码二羟萘酚-黑色素合成酶，它们的任何单基因突变子都形成不含黑色素的附着胞。三环唑 (tricyclazole) 等农药可以抑制 buf1 基因所编码的酶的活性，附着胞经三环唑处理后甘油的浓度明显低于野生型，使附着胞丧失穿透能力的高膨压，病原菌丧失致病性，但其本身对病原菌的毒性很小。已报道三环唑可以抑制 DHN 黑色素形成过程中1，3，6，8-4 羟基萘到 scytalone、1，3，8-3羟基萘到 Vermelone 的两步脱氢反应，能够有效专一地防治稻瘟病菌，是黑色素的生物合成抑制剂。本实验室采用不同浓度的黑色素培养玉米大斑病菌，结果发现，10 μg/ml 的三环唑浓度就可以抑制玉米大斑病菌黑色素的产生，且对菌落生长的影响很小。黑色素生物合成途径的特异抑制剂已经作为农药，用于防治可形成黑色素附着胞的真菌病害。

　　常用的化学药剂法防治植物真菌病害，不仅污染了环境也增大了病原菌的抗药性，尤其是一些化学农药的盲目使用会加强病原菌附着胞的黑化程度，给寄主带来更大的伤害。由于黑色素与病原菌的致病性密切相关，而且病原菌中黑色素与动植物体内黑色素合成途径不同，可以开发病原菌黑色素特定抑制剂来防治真菌病害。因此，明确黑色素种类及其生化合成途径和调控机制，研究在基因水平上对附着胞机械穿透力进行调节，可为真菌病害防治和新型杀真菌剂的研制奠定基础。

    注：
    （1）文章来源：微生物学通报，2006年第33卷第1期；
    （2）作者单位：河北农业大学真菌毒素实验室。

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