自从20世纪70年代中国成功实现杂交水稻三系配套以来，杂交水稻为中国的粮食增产做出了巨大贡献。水稻细胞质雄性不育( CMS )及育性恢复遗传机理研究一直受到广泛重视，特别是近十几年来，随着 DNA 分子标记和分子遗传连锁图谱的应用，CMS 育性恢复基因的定位取得较快进展，部分恢复基因还得到了克隆。

1 水稻细胞质雄性不育及其育性恢复遗传研究

　　从20世纪70年代后期起，国内外研究者应用经典遗传学分析方法，对水稻 CMS 育性恢复遗传机理进行了大量研究。由于不同学者采用的水稻材料和育性指标不同，所得结论不尽一致，但一般认为，野败型( CMS-WA )及与野败型具有相同或相似恢保关系的其它胞质不育类型的育性恢复主要由2对基因控制，红莲型和包台型的育性恢复主要由1对基因控制，而各种类型 CMS 的育性恢复还或多或少地受到微效基因的影响。

1.1 籼型细胞质雄性不育及育性恢复的遗传

　　野败型不育系为籼型细胞质雄性不育系，是中国三系杂交稻中应用最早且最多的类型，多年来其推广组合及面积在杂交稻中一直居主导地位。而且，近年来育成组合和推广面积呈上升趋势的印水型、冈型、D型和矮败型等胞质不育类型，与野败型不育系具有相似的恢保关系。有关野败型细胞质雄性不育性及恢复性的研究也最多。野败型不育系为孢子体不育，其育性恢复的遗传特性在不同研究中表现不尽一致，多数研究表明，该性状由2对独立分离的主效基因控制，但在一些研究中则分别表现为单主效基因控制、2对连锁的主效基因控制或多基因控制。

　　少数研究应用不育系/恢复系杂交组合构建的 F₂ 群体，发现可育株和不育株分离比例符合3:1的单基因分离比，且未出现半不育/半可育株或这种中间类型材料极少，因此认为相应恢复系对不育系的育性恢复由单个主效基因控制，显示出这种恢复效应的恢复系包括 IR29、IR4628、Mangala 和 IR26 等。部分研究则根据自花授粉作物 F₂ 和测交一代群体基因对数的估算公式：k=(lgn-lgm)/lg(1/4)(其中n为分离群体的总观察数，m为隐性纯合基因型个体数，k为基因对数)，以不育株数为隐性纯合基因型个体数，计算取整数得出k为2的结果，表明野败型不育性及其恢复由2对基因控制。多数研究则根据 F₂ 群体中1不育:15可育的分离，以及 BC₁F₁ 和测交群体中1不育:3可育或1不育:1半不育:2可育的分离比，也得出2对隐性不育基因或2对显性恢复基因的结论。

　　在上述研究中，无论其结论是单基因遗传，还是两对基因遗传，都是采用一般经验标准将群体划分为不同的育性组别，然后根据经典遗传理论和统计分析方法推断控制性状的基因对数、不同基因的相对效应及基因间互作存在与否。实际上，大多数群体的育性分离呈双峰型连续分布，少数群体的育性分离呈典型的正态分布或多峰分布，育性群体都无明显的育和不育的划分界限，因此研究者一致认为，野败型细胞质雄性不育性和恢复性受两对主效基因作用的同时，还可能受微效基因的修饰作用。

　　红莲型( CMS-HL)也为籼型细胞质雄性不育系类型，但红莲型和野败型在恢保关系、遗传特点、花粉败育的细胞学特征上明显不同。红莲型属于典型的配子体不育类型，不育系的不育性受1对隐性核基因和不育胞质共同控制。

1.2 粳型细胞质雄性不育及育性恢复的遗传

　　生产上应用的粳稻不育系主要为包台型( CMS-BT )，20世纪70年代日本新长城首次研究认为 BT 型细胞质雄性不育属配子体不育，育性恢复受一对核恢复基因 Rf-1 控制。其后胡锦国对4种质源的不育系研究发现，粳型杂交稻( BT 型和滇一型)的不育系是受1对隐性核基因和不育胞质共同控制的。但是贺和初通过对 BT 型和滇一型“三系”以及杂种 F₁、F₂、BC₁ 和 AF₁ [不×(保×恢)]等世代的育性分析，发现这两种类型不育系的部分杂交组合表现为1对育性核基因和细胞质基因共同控制的遗传，而另一部分杂交组合表现为两对育性核基因和细胞质基因共同控制的遗传，由此认为，粳型杂交稻的育性基因型因组合不同而不尽相同，同一不育系或恢复系在不同的组合中可能表现不同的育性遗传，同时还认为这两种类型不育系属于孢子体和配子体基因型共同控制的育性类型。另外，也有学者认为 BT 型细胞质雄性不育的恢复是由强弱各1对独立的恢复基因控制，并发现 Rf-1 座位上至少有4个复等位基因。

2 细胞质雄性不育育性恢复基因的定位

2.1 籼稻恢复基因的定位

　　国内外学者针对野败型的主效恢复基因进行了大量的分子标记定位研究，多数以恢复系 IR24 和明恢63为材料。为了定位 IR24 中的野败型恢复基因，Zhang 等以珍汕97为受体建立了携带 IR24 恢复基因( Rf-3 和 Rf-4 )的近等基因系，通过应用珍汕 97A 与 ZSR21 (一个携带 Rf-3 的近等基因系)杂交的 F₂ 以及珍汕 97A 与 IR24 杂交的 F₂ 两个定位分离群体结合 RAPD 标记筛选，将 Rf-3 定位于第1染色体，且确认 Rf-3 与3个 RAPD 标记( OPK05-800、OPU10-1 100和 OPW01-350)和3个 RFLP 标记( RG532、RG140 和 RG458 )有连锁关系。以上研究没有定位到 Rf-4。为了定位 IR24 中的另一主效恢复基因 Rf-4，张群宇等以 Rf-4 恢复基因近等基因系为材料，利用对水稻酵母人工染色体( YAC )克隆进行亚克隆并筛查 RFLP 的方法对 PC-4 进行分子标记定位，结果从 YAC4892 获得的亚克隆 Y3-8 与 Rf-4 座位的连锁距离为 0.9 cM，从 YAC4630 获得的亚克隆 Y1-10 与 Rf-4 座位的连锁距离为3.2 cM，从而把 Rf-4 定位于第10染色体的特定位置。Tan 等和景润春等也都在第10染色体长臂定位到了 IR24 中的野败型主效恢复基因，其位置和效应都类似 Rf-4，同时 Tan 还在第10染色体的另一个位置探测到一个效应较弱的育性恢复 QTL，该基因与 RFLP 标记 R2309 和 RG257 连锁。Yao 等和何光华等分别用珍汕 97A/明恢63的 F₂ 极端育性群体，采用集团分离分析法( Bulked Segregant Analvsis，BSA )对明恢63的野败型恢复基因进行定位，结果都定位到两对主效恢复基因，其中位于第10染色体长臂中部的基因表现主效恢复作用，而位于第1染色体的基因恢复效应较弱。

　　遗传研究还认为各种类型 CMS 的育性恢复还或多或少地受到微效基因的影响，一些学者应用 QTL 分析，也定位到一些野败型微效恢复基因。Zhu 等用野败型强恢复系圭630与粳型广亲和品种02428配组的 F₁ 经花药培养，获得81个双单倍体( Doubled Haploid，DH )群体，用双单倍体群体和珍汕 97A 的测交群体对野败型恢复基因进行定位，经 QTL 分析，鉴别出圭630中的4个育性恢复 QTL 位点，其中2个 QTL 表现为主效，分别位于第3和4染色体上；另外2个起微效恢复作用，分别位于第2和5染色体上，除此之外，他们还推测在第6和12染色体上可能存在其它的微效育性恢复 QTL 位点，由于定位群体较小，使得效应小、LOD 值低的 QTL 没能检测出来。庄杰云等也采用 QTL 分析法，对野败型育性恢复基因进行定位并分析了基因效应，首先建立珍汕 97B 与密阳46配组的 F₆ 重组自交系群体( Recombinant Inbred Line，RIL )，然后用 RIL 群体分别与珍汕 97A 测交，227个株系的测交群体用于恢复基因定位。经 QTL 分析，检测到恢复系密阳46中控制野败型育性恢复的1个主效 QTL (qRf-10)和3个微效 QTL (qRf-1、qRf-7、qRf-11)，主效 QTL 位于第10染色体，3个微效 QTL 分别位于第1，7，11染色体上。同时认为，4个恢复基因之间主要表现累加效应，但主效基因之间以及主效基因和微效基因之间还可能存在其它复杂形式的互作。为了进一步验证密阳46中的野败型恢复基因，笔者将[珍汕97A/(珍汕97B/密阳46)F₆]的测交定位群体扩大为704个株系，在恢复基因的候选区间选择标记进行育性恢复 QTL 定位及效应分析，结果表明主效 QTL 位于第10染色体长臂中部，另外3个微效 QTL 分别位于第1染色体短臂、第10染色体长臂近着丝粒处和第11染色体短臂近着丝粒处，其结果和庄杰云等前期定位结果基本一致。

　　综上所述，不同的研究者采用的恢复系材料不同，基因定位方法不同，所得的野败型恢复基因的定位结果不尽一致。其中，多数研究将野败型的两对主效恢复基因分别定位于第1染色体短臂和第10染色体长臂中下部，其中位于第10染色体长臂中下部的 Rf-4 恢复基因效应较强，表现出稳定的主效效应，而位于第1染色体短臂的 Rf-3 效应较弱，在不同的研究中检测结果有一定的差异。但是，也有研究表明野败型恢复系圭63的两对主效恢复基因分别位于第3和第4染色体上，而恢复系 IR36 的两对主效恢复基因则分别位于第7和第10染色体上。微效恢复基因的定位结果差异也很大。造成以上定位结果产生差异的原因，是由于恢复系材料本身遗传背景的差异所致，还是受环境条件和试验误差的影响，还需要进一步验证。

　　红莲型不育系作为另一种籼型不育系，近几年来对其恢复基因的定位研究进展较快。黄青阳等以(丛广 41A×密阳23)×丛广 41B 回交群体为基因定位群体，采用 BSA 法，对红莲型恢复基因进行了初步定位，认为红莲型恢复基因位于第10染色体上，且与微卫星标记 RM258 连锁，连锁距离为7.8 cM。Liu 等用 BCF₁ 群体对密阳23和93-11两个恢复系的恢复基因进行了精细定位，结果发现第10染色体上有两个红莲型恢复基因座位，即 Rf-5 和 Rf-6(t)，其中一个来自于密阳23，另一个来自于93-11，Rf-5 与 SSR 标记 RM3150 完全共分离且与 RM5373 的遗传距离为1.3 cM，而 Rf-6(t)则与 SSR 标记 RM5373 完全共分离。由此他们认为，这两个恢复基因虽然相距很近，但不在一个基因座位上，通过 BAC 库筛选结合生物信息学研究分析，将 Rf-6(t) 基因限定在66 kb 区间内。

2.2 粳稻恢复基因的定位

　　20世纪七八十年代就有 BT 型恢复基因 Rf-1 位于第10染色体上的报道，近年来日本学者对 Rf-1 恢复基因的定位及克隆作了更为深入的研究。他们首先利用分子标记对 Rf-1 基因的具体位置进行了连锁分析。Akagi 等以含有 Rf-1 和不含有 Rf-1 的两个近等基因系为材料，通过 ISSR 分子标记筛选，检测到与恢复基因 Rf-1 紧密连锁的共显性标记 OSRRf，该标记与 Rf-1 的遗传距离为3.7±1.1 cM。Ichikawa 等也用以上两个近等基因系为材料，结合 RAPD 分子标记分析，将 Rf-1 基因定位于第10染色体长臂的中部，并与显性标记 fL601 紧密连锁，遗传距离为4 cM。Komori 等选取第10染色体已知的9个与 Rf-1 连锁的 RFLP 标记，用含有1024个个体的分离群体，对 BT 型恢复基因进行了精细定位，结果把 Rf-1 精细定位于 S12564 Tsp 5091 和 C1361MwoI 区间内，两标记间的距离为0.3 cM。

　　有关滇一型( CMS-D1 )恢复基因的定位研究也有了一定进展。赵银河等用混和品系分析方法( Bulked Line Analysis，简称 BLA )对滇一型细胞质雄性不育的恢复基因进行了初步定位，结果表明 PMRF、RM228 和 OSR33 标记与滇一型恢复基因连锁，由于 PMRF、RM228 和 OSR33 标记的引物是设计在第10染色体长臂的中部，所以也认为滇一型的一个育性恢复基因位于第10染色体长臂的中部。谭亚玲和谭学林用位于水稻第10染色体的微卫星标记 OSR33 和 RM228 对285份滇一型材料(包括不育系及相应的保持系106对，不育系与杂交品系的测交组合及相应的测交父本179对)进行了恢复基因的分子鉴定，结果表明 OSR33 和 RM228 可用于鉴别滇一型恢复系，其准确率达90％以上，说明这两个标记与滇一型恢复基因紧密连锁。以不育系与杂交品系的测交组合群体为材料，进行滇一型育性恢复 QTL 检测，结果在 OSR33 和 RM228 之间探测到1个与育性恢复有关的主效 QTL，可解释83.2％的表型变异，与 OSR33 和 RM228 的遗传距离分别为3.3 cM 和7.0 cM。Tan 等用由119个植株组成的滇一型不育系黎榆 A 与南34杂交的 F₂ 群体对滇一型育性恢复 QTL 进行定位，结果也在第10染色体上探测到1个滇一型主效恢复基因，该基因与 OSR33、RM228 紧密连锁，遗传距离分别为3.4 cM 和5.0 cM。

2.3 不同胞质类型的恢复基因在染色体上的分布

　　总结多年来不同胞质类型的恢复基因定位结果，可以看出野败型、红莲型、BT 型和滇一型的主效恢复基因都位于第10染色体长臂中部(表1)，即染色体的相同或相近区域。谭学林等对 WA 型和 BT 型雄性不育恢复基因的位点进行比较时还发现，WA 型的主效恢复基因与 RFLP 标记 C1361 紧密连锁，BT 型的恢复基因与 RFLP 标记 G2155 连锁，而 C1361 与 G2155 相距仅3.9 cM，处在染色体上的相近区域。黄青阳等发现 RM258 与 HL 型恢复基因连锁；何光华等研究表明该标记也与 WA 型恢复基因连锁。还有研究表明野败型的主效恢复基因 Rf-4、红莲型 Rf-5 以及滇一型的育性恢复基因分别与 (RM171) OSR33 标记有一定的连锁关系。以上说明，各种胞质类型主效恢复基因可能同抗病基因一样在染色体上呈紧密连锁的基因簇分布，这些基因属于复等位基因还是为同一基因家族的不同基因，还需进行基因等位性研究分析或基因克隆验证。

3 恢复基因的精细定位与克隆

　　细胞质雄性不育是一种广泛存在于高等植物中的自然现象，表现为母性遗传、花粉败育和雌蕊正常。研究表明，其不育主要是由线粒体基因组引起的，而育性恢复要靠细胞核基因组中恢复基因( Rfs )的作用来实现。精细定位并克隆恢复基因，对于进一步研究恢复基因对不育胞质基因的调控机制、恢复系的选育以及分子育种都有十分重要的意义。基因的精细定位需要建立近等基因系衍生群体，一方面要求在目的基因的基因组区间内发展大量标记，将目的基因限定在尽可能小的区间内，另一方面要求将目的基因分解成单个的孟德尔因子并分析和分解基因效应，在精细定位的基础上进一步研究其克隆。目前，有关恢复基因的克隆工作取得了可喜的进展。Cui 等应用转座子标签法在玉米中克隆了 T 型恢复基因 Rf-2，其编码线粒体乙醛脱氢酶，该酶可以弥补因新陈代谢紊乱而造成的雄性不育，从而起到育性恢复的作用。Bentolila 等用图位克隆的方法克隆了矮牵牛中的一个 Rf 基因，其编码的产物是包括14个重复的 PPR 基数的线粒体锚定蛋白。2003年，红萝卜中的一个恢复基因 Rfk1(Rfo) 也得到了成功的克隆，该基因编码产物也是一种线粒体锚定蛋白，该蛋白包括16个重复的 PPR，即35个氨基酸。2004年，水稻 BT 型恢复基因 Rf-1 也有了成功克隆的报道，Rf-1 基因也编码一个由16个重复的 PPR 组成的线粒体锚定蛋白，Akagi 还认为该 Rf-1 基因包含两个开放阅读框，分别记为 Rf-1A 和 Rf-1B，其中，Rf-1B 不具有恢复功能，只有 Rf-1A 具有恢复功能，由此他们认为只有 Rf-1A 是具有恢复功能的 Rf-1 基因。以上研究，为更多恢复基因的克隆提供了理论和技术指导，也为今后更深入地研究水稻细胞质雄性不育及育性恢复的分子机制奠定了基础。

    注：
    （1）文章来源：杂交水稻，2006年 第21卷 第3期；
    （2）作者单位：山东省水稻研究所 等。