高等植物的顶端生长以及众多侧生器官的相继分化和发育，是高等植物最基本的生长发育问题，直接关系到植株各部分器官的组成、个体的大小和经济价值的高低，因而成为近年来植物功能基因组研究的一个重要热点。植物的茎尖分生组织 (SAM，shoot apical meristem) 是位于生长点的一群细胞，它从胚胎的形态发生之初开始启动，一直维持分生状态并贯穿植物生长发育的始终。从组织结构上看，茎尖分生组织被分为两个区：一个称为中央区，由一群分裂速度较慢的茎细胞所组成，为维持顶端生长所必需；一个称为周边区，由一群分裂速度较快的生成细胞 (founder cells) 所组成，在合适的条件下启动侧生器官原基的形成和发育。茎尖分生组织的维持需要在中央区茎细胞和周边区生成细胞之间保持一种平衡，这种平衡的打破往往导致侧生器官原基的启动和形成 (Bowman and Eshed，2000；Clark，2001)。高等植物的侧枝、叶片、花序、花器官等均属于侧生器官。在营养生长期，叶片以一种严谨的方式从茎尖分生组织的周边区持续形成。而进入生殖生长后，侧向分生组织转向形成花序分生组织，进而形成花分生组织，此后，在花分生组织的特定位置形成各轮次花器官。高等植物地下部根系的顶端(主根)生长和侧向器官(侧根和分支根等)分化发育也受到同种机制的调控。

　　分子遗传学的研究结果已经揭示，有几类基因或基因家族，包括 CLAVATA (CLV)、WUSCHEL (WUS)、KNOX、MYB、YABBY、LBD 等的成员，通过形成一种复杂的调控网络，使植物在不同生长发育阶段的顶端生长和侧向生长处于不同水平的平衡状态，以维持茎尖分生组织的生长，同时按顺序启动各侧生器官的分化与发育。其中，CLV 与 WUS 信号途径相互作用以一种反馈抑制的方式参与调控分生组织的大小 (Brand et al.，2000；Schoof et al.，2000)。KNOX 基因在茎尖生长点特异表达而在侧生器官中的表达受到抑制 (Jackson et al.，1994；Long et al.，1996；Nishimura et al.，1999；Sentoku et al.，1999)。STM (KNOX 基因家族成员之一)的功能丧失突变体导致不能形成正常的茎尖分生组织，同时表现负向调节 AS1 的功能 (Byrne et al.，2000)；而 AS1 编码一个包含 MYB 结构域的转录因子(与金鱼草中的 PHANTASTICA 及玉米中的 ROUGH SHEATH2 为同源基因)，在侧生器官原基中特异表达(Waites et al.，1998；Timmermans et al.，1999；Tsiantis et al.，1999)，并且突变体 as1 对 stm 的突变表型具有上位性，AS1 的过量表达会抑制 KNOX 基因在叶片中的表达 (Byrne et al.，2000；Ori et al.，2000)。YABBY 基因家族成员则主要涉及侧生器官远轴侧细胞的特化，这类基因的突变往往导致侧生器官极性分化的丧失及异常侧生分生组织的形成 (Sawa et al.，1999；Siegfried et al.，1999)。

　　最近，研究发现高等植物中特有的一类新基因家族——LBD 基因家族，参与了侧生器官原基的启动、形态建成 (Iwakawa et al.，2002；Chalfun-Junior et al.，2005；Liu et al.，2005)，尤其，可能参与了侧生器官与顶端分生组织之间的边界的建立 (Shuai et al.，2002)，对高等植物地上部、地下部的部分特定器官的形成与发育具有重要影响。本文主要综述有关 LBD 基因家族的研究进展，并对其在高等植物发育中可能所具有的功能进行总结和探讨。

1 LBD 基因的结构域特征

1.1 LOB 结构域特征

　　LBD 基因是指含有 LOB (lateral organ boundaries) 结构域的基因。Shuai 等(2002)通过增强子陷阱的方法，首先在拟南芥中鉴别出一个在侧生器官基部特异表达的基因，命名为 LOB 基因。以其氨基酸序列作探针，搜索拟南芥的基因组数据库，共发现有42个成员与其存在一定的序列相似性，尤其是氨基端具有保守的结构域，称为 LOB 结构域。LOB 结构域大概跨越100个氨基酸左右的长度，其最显著的特征是含有一个保守的 C 区结构域。C 区由22个氨基酸组成，包含有4个绝对保守的半胱氨酸( Cys )，而形成一个类似于锌指的 CX₂CX₆CX₃C 结构域，这样的锌指结构往往具有与其它微分子(如 DNA 或蛋白质等)之间的相互作用的功能 (Pavletich and Pabo，1991：Wang et al.，1998)。LOB 结构往往还包含有一个跨度为49个氨基酸序列的 GAS 区结构域，它一般以 FX₂VH 序列开始而以 DP(V/I)YG 序列结束 (Shuai et al.，2002)。

1.2 LBD 基因的分类

　　拟南芥中的42个 LBD 基因可分为两类(Iwakawa et al.，2002；Shuai et al.，2002)，Ⅰ类包含36个基因，预测编码形成与 LOB 基因有较高同源性的蛋白(同源性为25％～82％)；Ⅱ类包含有6个基因，预测编码蛋白与 LOB 或其它Ⅰ类基因的编码产物有较低的同源性(同源性为28％～33％)。Ⅰ类 LBD 基因含有保守的 C 和 GAS 区结构域，同时，DP(V/I)YG 序列中脯氨酸座位存在于所有的Ⅰ类蛋白中。Ⅱ类 LBD 基因同样含有上述2个保守结构域，并因这样的2个结构域紧密联系在一起而可被看成一个大的结构域。两类 LBD 基因的 C 区结构域中，4个半胱氨酸座位间的间隔氨基酸数目是一致的，但氨基酸种类不同。Ⅰ类 LBD 基因一致序列是 CAACKFLRRKCX₃C，而Ⅱ类 LBD 基因一致序列是 CNGCRVLRKGCSE(D/N)C。与Ⅰ类 LBD 基因相比，Ⅱ类 LBD 基因最显著特征就是其包含有更多的半胱氨酸座位，通常为9～13个，而Ⅰ类仅有4～7个。此外，Ⅰ类 LBD 基因在 LOB 结构域末端的30个左右氨基酸会以亮氨酸拉链形式 (LX₆LX₃LX₆L) 形成一个“卷曲螺旋 (coiled coil)”二级结构，而参与与其它微分子间的相互作用 (Landschultz et al.，1988；Shuai et al.，2002)；而Ⅱ类 LBD 基因不能形成“卷曲螺旋”二级结构。

　　单子叶模式植物水稻的基因组中同样包含有大量 LBD 基因。Yang 等(2005)最近鉴别出水稻中共含有35个 LBD 基因成员，并可被分为3类。与拟南芥等双子叶植物相似，水稻的 LBD 基因同样具有保守的 C 区结构域、GAS 区结构域等 LOB 结构域的典型特征；同样是Ⅰ类(29个成员)以“LX₆LX₃LX₆L”亮氨酸拉链的形式形成二级“卷曲螺旋”结构，而Ⅱ类(5个成员)不能形成此二级结构，但Ⅱ类包含有更多的半胱氨酸座位等，从而揭示了 LOB 结构域在单双子叶植物进化中的保守性。但水稻中同时还包含有第Ⅲ类的 LBD 基因，只有1个成员，位于水稻的第1条染色体上，包含有2个 LOB 结构域。水稻的Ⅰ类 LBD 基因，分为5个亚类(Ⅰa、Ⅰb、ⅠC、Ⅰd、Ⅰe)，不同亚类具有部分特异氨基酸序列，如 Ⅰb 含有“CGAC”和“CKFL-RRKC”、 Ⅰa 和 Ⅰd 含有“CAAC”以及 Ⅰa、Ⅰb、ⅠC、Ⅰd 含有“PVYG”等。水稻中的部分 LBD 基因为水稻所特有(如 Ⅰa、Ⅰd、Ⅰe 等)，拟南芥中的部分 LBD 基因在水稻中并不存在( At 类)，而另一些 LBD 基因为两物种所共有(如Ⅰb、ⅠC 和Ⅱ)。进一步的研究还显示水稻不同籼、粳亚种间的 LBD 基因呈一一对应的关系，并在染色体上具有相同的分布(Yang et al.，2005)。

2 LBD 基因的表达模式及功能

2.1 LBD 基因的表达模式

　　建立在 RT-PCR 技术基础之上的表达模式显示，无论是在拟南芥或是在水稻中，不同 LBD 基因的表达方式呈现出多样性。部分 LBD 基因在全生育期或在所有取样的器官中均有表达，而部分 LBD 基因仅在特定组织或特定生育阶段表达，显示典型的时空特异表达的特点，揭示出 LBD 基因功能的多样性 (Shuai et al.，2002；Yang et al.，2005)。Yang 等(2005)在水稻中还根据其序列的同源性及其表达方式的相似性，对其亲缘关系的远近或进化关系进行了分析。亚细胞定位结果显示，水稻和拟南芥中的 LBD 基因成员 ARL1 (ADVENTOUS ROOTLESS1) 和 AS2(ASYMMETRIC LEAVEA2)，均为核蛋白(Liu et al.，2005；Iwakawa et al.，2002)。LOB、ASL1 等部分 LBD 基因的启动子与 GUS 基因构建的融合表达载体转化拟南芥植株，表达模式显示其具有在侧生器官的基部或近轴面强烈表达的特性(图1)，这就暗示了 LBD 基因可能参与侧生器官边界的建成 (Shuai et al.，2002；Chalfun-Junior et al.，2005)。

2.2 LBD 基因的功能

　　由于 LBD 基因是新发现的植物所特有的一个基因家族，有关 LOB 结构域在高等植物发育中的确切功能尚不清楚。但是，对已克隆的几个 LBD 基因功能的初步分析还是为我们了解其功能提供了部分线索。LOB 是第一个分离的属于 LBD 基因家族的基因，其在转座子插入引发的功能丧失的情况下不能观察到明显的表型突变，表明 LOB 在拟南芥的发育过程中存在一定程度的功能冗余。但以花椰菜病毒的 35S 强启动子与 LOB 编码序列构建的融合表达载体转化野生型植株，可观察到植株矮小、叶片向上卷曲、叶柄和花梗变短、花器官畸形等明显表型的变化(Shuai et al.，2002)。拟南芥中另一个 LBD 基因家族成员——AS2，其突变体 as2 呈现出叶片不对称发育或畸形、叶脉发育不完全等表型，则揭示了部分 LBD 基因可能参与了高等植物器官的形态建成 (Serrano-Cartagena et al.，1999；Ori et al.，2000；Sun et al.，2000；Semiarti et al.，2001：Xu et al.，2003)。异位过表达 AS2 的转基因拟南芥植株出现了较短的初生根、狭小而上卷的子叶、叶片和花萼远轴面形成毛刺状增生物、花梗向下弯曲等表型；同时，组织显微观察还揭示 AS2 的过表达干扰了侧生器官正常近远轴极性的建立，导致远轴面的细胞类型被近轴面的细胞类型部分替代 (Lin et al.，2003；Nakazawa et al.，2003)。AS2 在拟南芥中亲缘关系最近的同源基因 ASL1 (亦称 LBD36)，同样是 LBD 基因家族成员，其过表达会引起花和角果下垂的表型 (Chalfun-Junior et al.，2005；Nakazawa et al.，2003)。ASL1 的功能丧失突变体 asl1 没有观察到明显的异常表型，但 asl1/as2 双突变体表现出花萼窄小、内部花器官暴露、花萼和花瓣向外卷曲、提前开花等突变表型，这表明 ASL1、As2 同时参与了花器官的发育并在该阶段存在一定的功能冗余 (Chalfun-Junior et al.，2005)。

　　水稻中克隆的第一个 LBD 基因——ARL1(ADVENTITIOUS ROOTLESS1)，或称 CRL1 (CROWN ROOTLESS1)，其功能丧失突变表现为不能形成正常的不定根/从生根、生长素敏感性的丧失、根生长的向地性的丧失等表型，但地上部没有明显的形态异常(Liu et al.，2005；Inukai et al.，2005)。本实验室通过 T-DNA 标签的方法，最近也分离了水稻中的一个 LBD 基因家族成员，初步命名为 DH1(DEGENERATED HULL 1)，dh1 突变体呈现颖花的颖壳缺失或颖壳发育的提前终止、雌雄蕊数目异常、部分雄性不育等表型；过量表达 DH1 的转基因水稻表现为植株矮小、节间和颖花的枝梗缩短、叶片向下低垂等表型(李爱宏，2006，私人通讯)。这些结果表明水稻中的 LBD 基因，与拟南芥相比，在侧生器官的发育方面可能有着更加重要的作用。

3 LBD 基因与其它基因或基因家族间的相互关系

　　在 LBD 基因家族与其它基因间的相互关系或参与的代谢调控途径研究中，研究得最清楚的是 AS2 基因。AS2 基因与其它基因或基因家族的关系主要有以下几类：(1)抑制 KNOX 基因的表达。AS2 基因功能丧失突变体 as2，表现为 KNOX 基因 KNAT1 (亦称为 BP 基因)、KNAT2 和 KNAT6 在叶片中转录水平的累积 (Byrne et al.，2000；Ori et al.，2000；Semiarti et al.，2001)；而 35S :: AS2 的转基因拟南芥植株表现出与 bp 突变体 (BP 基因的功能丧失突变体) 类似的表型，RT-PCR 及 pKNOX :: GUS 转基因植株中 GUS 表达模式结果显示在 AS2 过量表达的情况下，BP、KNAT2 和 KNAT6 的表达均受到了抑制(图2)(Lin et al.，2003)。但同是 KNOX 基因家族成员的 STM 基因，在异位过表达的情况下却表现为转录水平的上升，而在 as2/stm 双突变体中，stm 的突变表型则部分受到抑带 (Lin et al.，2003；Byrne et al.，2002)。上述结果表明 AS2 基因与 KNOX 基因家族不同成员之间的关系可能是不同的，AS2 基因会抑制 BP、KNAT2 和 KNAT6 的表达，但不能抑制 STM 的表达，相反其表达会被 STM 所抑制。(2)调节其它 LBD 基因的表达。AS2 基因会正向调节 LOB 基因的表达，as2 突变体中 LOB 基因的转录水平随之下降 (Byrne et al.，2002)。(3)与 MYB domain 基因家族成员相互作用。as2 突变体表现与 MYB 结构域基因家族成员——AS1 基因的功能丧失突变体 as1 相似的突变表型 (Serrano-Cartagena et al.，1999；Ori et al.，2000；Sun et al.，2000；Semearti et al.，2001)，暗示 AS1、AS2 可能涉及共同的功能途径。酵母双杂交结果显示 AS2 与 AS1 编码的蛋白间存在物理上的相互作用，形成一个功能复合物而共同参与叶片极性的建立(Xu et al.，2003)；而在 AS2 异位过表达的情况下，则会引起类 MYB 结构域基因成员 PHB 和 PHV 转录水平的上升，表明 AS2 对 PHB 和 PHV 起正向调节的作用 (Lin et al.，2003)。(4)与 YABBY 基因家族成员间相互作用。异位过表达的 AS2 会导致 YABBY 基因成员 FIL (FILAMENTOUS FLOWER)、YAB3 (YABBY3) 转录水平的下降，而在 fil/yab3 双突变体中，AS2 的转录水平明显上升，表明 AS2 与 YABBY 基因之间可能存在一种相互抑制的关系。但在 as2 突变体中，FIL 与 YAB3 的转录水平却没有明显改变，又暗示 AS2 可能并不为调节 FIL 与 YAB3 的表达所必需 (Lin et al.，2003)。此外，拟南芥中的 ERECTA 基因(ER)可能还涉及到 AS1-AS2 的共同信号途径，而参与叶片极性的建立，因为在 ER 突变的遗传背景下，as2 会有较高频率“莲座叶”的突变表型产生(Xu et al.，2003)。AS2 与各类基因或基因家族间的相互关系可总结示于图3。

　　与 AS2 亲缘关系最近的 ASL1 基因，同样表现出抑制 KNOX 类的 BP 基因的表达 (Chalfun-Junior et al.，2005)。AS2 和 ASL1 如何与其它基因间进行相互作用的详细分子机理并不清楚，但从水稻中克隆的 LBD 基因，却显示了其参与信号代谢途径的独特作用方式。如水稻中的 CRL1 基因，与生长素的信号代谢途径相关，在野生型植株中，外源施用或内源合成的生长素，可促进 AUX/IAA 蛋白的降解，从而激活生长素响应因子 (ARF) 的释放。CRL1 基因的启动子区域，存在两个生长素响应元件 (AuxRE)，其中 AuxRE2 可与释放的 ARF 相互作用，从而激活其下游一系列功能基因的表达而调控不定根的形成 (Inukai et al.，2005)。本实验室分离的 DH1 基因，研究发现其启动子区域存在大量的光调控元件 (Light-regulated element)，而且发现 dh1 突变体在不同光照条件下呈现不同的表型，上述结果均初步揭示 DH1 基因可能与光调控途径相关(李爱宏，2006，私人通讯)。

4 小结与讨论

4.1 关于 LBD 基因家族成员功能的冗余与多样性

　　大量的研究显示，拟南芥的基因组曾经经历了几次重要的全基因组序列的重复 (Lynch and Conery，2000；Rase et al.，2003；Simillion et al.，2002；Wolfe，2001)。最近，水稻中也鉴别出了长度约占整个基因组序列45％的10个重复的区段(Wang et al.，2005)。这种全基因组或部分染色体区段重复事件的发生，为基因家族的存在提供了物质基础。拟南芥和水稻中众多 LBD 基因的存在可能就是这种重复事件的产物(Yang et al.，2005)。重复事件导致的基因家族成员之间序列的相似性，尤其是保守结构域的存在，使不同基因家族成员之间可能存在大量的功能冗余。

　　拟南芥和水稻中的 LBD 基因家族，不同基因家族成员之间可能存在大量的功能冗余。这种功能冗余有两个层次：(1)全生育阶段的功能冗余，使其在功能丧失的情况下不产生突变表型。如 LOB、ASL1 基因的功能丧失突变体没有观察到明显的表型变化，但在过表达的情况下可观察到异常表型 (Shuai et al.，2002；Chalfun-Junior et al.，2005)。(2)部分生育阶段或特定器官/发育部位的功能冗余，部分 LBD 基因可能参与了多个组织、器官的形态建成或在多个生育阶段或部位表达，对特定组织器官的生长发育而言，其功能是独特的，但在其它表达阶段，其功能却是冗余的。如 AS2，其功能丧失突变体表现叶片发育的不对称性、叶脉发育不完全及极性的缺失，说明 AS2 对叶片、叶脉的发育其功能是独特的。但 AS2 在花器官中虽然表达，却没有明显的突变表型，而在 as2/asl1 双突变中，表现明显的花器官发育畸形，揭示这2个基因在花器官的发育过程中功能是冗余的 (Serrano-Cartagena et al.，1999；Ori et al.，2000；Sun et al.，2000；Semiarti et al.，2001；Xu et al.，2003；Chalfun-Junior et al.，2005)。

　　在物种进化过程中，由于突变等复杂的原因可能导致家族内不同 LBD 基因序列的多样性。这种序列多样性的保留可能导致不同 LBD 基因功能的多样性。拟南芥和水稻中不同 LBD 基因表达方式的多样性就揭示了其功能的多样性(Iwakawa et al.，2002；Shuai et al.，2002；Yang et al.，2005)。

4.2 关于 LOB 结构域的功能

　　首先，从已克隆的基因的功能可以推知，LBD 基因参与了高等植物侧生器官的发育，尤其是可能参与了侧生器官边界的建成。因为无论是 ARL1 对不定根、AS2 对叶片、DH1 对颖花，均是对侧生器官发育的影响 (Serrano-Cartagena et al.，1999；Ori et al.，2000；Sun et al.，2000；Semiarti et al.，2001；Xu et al.，2003；Inukai et al.，2005)，而且所有 LBD 基因均会在侧生器官中表达，尤其部分 LBD 基因在侧生器官的基部表达(Shuai et al.，2002；Inukai et al.，2005；Yang et al.，2005)。此外，参与侧生器官近远轴极性建立可能是 LBD 基因普遍的功能，AS2、ASL1、LOB、DH1 过表达的表型普遍表现叶片上卷、叶片或角果下垂就验证了这一点(Lin et al.，2003；Chalfun-Junior et al.，2005；Shuai et al.，2002)。

　　其次，DH1 与 AS2、ASL1、LOB 和 ARL1 相比，虽然过表达的表型有所不同，(除 ARL1 没有过表达的研究信息外)，但 DH1 与 AS2、ASL1、LOB 在过表达的情况下普遍表现植株矮小、节间变短、花梗(花柄)或穗轴变短的表型 (Lin et al.，2003；Chalfun-Junior et al.，2005；Shuai et al.，2002)，这就暗示 LBD 基因参与抑制或负向调节 KNOX 基因的表达可能是一个普遍现象，而 KNOX 基因家族成员为 SAM 的维持和发育所必须，具有促进 SAM 细胞增殖的功能 (Veit，2004；Hake and Ori，2002；Takada and Tasaka，2002)。至于为何 LBD 基因的过量表达会导致植株矮小及节间变短、花梗(花柄)变短，Springer 等(2005，http://www.cepceb.ucr.edu/members/springer.htm) 曾提出可能与油菜素内脂的信号代谢途径有关，但有关这方面的研究还没有正式报道。

　　因此，尽管 LOB 结构域的确切功能还未知，但 LBD 基因家族普遍呈现的参与侧生器官近远轴极性的建立及抑制 KNOX 基因家族成员的表达等功能，在单、双子叶植物中具有保守性，这可能是 LOB 结构域潜在功能的重要方面。

4.3 关于 LBD 基因与其它基因间的相互作用

　　LBD 基因具有的保守卷曲螺旋结构 (coiled coil structure)，可能涉及蛋白质间的相互作用 (Shuai et al.，2002)。最近报道的 AS1 (一个 MYB 结构域基因家族成员)，其编码蛋白通过与 AS2 编码蛋白物理上的相互作用而形成一个功能复合物，就验证了这一点 (Xu et al.，2003)。其次，LBD 基因家族成员之间共有的、类似的两亲卷曲螺旋结构，为基因家族内不同成员之间的相互作用提供可能 (Newman et al.，2000；Immink et al.，2002)，AS2 对 LOB 基因的正向调节就提供了这方面的暗示(Lin et al.，2003)。

　　ARL1 基因启动子区域存在的 AUxRE，使其能够与 ARF 相互作用，介导生长素信号，从而参与不定根的形成和发育(Liu et al.，2005；Inukai et al.，2005)。我们最近发现的 DH1 基因，其启动子区域存在大量的光调控元件，而且其突变表型与光照存在很大的关联。这些均表明不同的 LBD 基因与其它基因之间的相互作用形式是多方面的，除了共有的 LOB 结构域所具有的相似功能外，部分 LBD 基因其启动子区域存在的顺式调控元件可能是其表现独特功能的重要原因。

　　由于 LBD 基因家族是一个新发现的植物所特有的基因家族，已克隆的 LBD 基因还仅局限于拟南芥和水稻等模式植物中的少数几个，因而对其在植物器官分化、发育过程中的具体功能的研究还处于起始阶段，随着更多的 LBD 基因的鉴定、分离和克隆，对其确切功能和参与的代谢调控途径等知识的了解方面将会越来越深入，从而为详晰其作用机制和将其利用、服务于人类奠定基础。

    注：
    （1）文章来源：分子植物育种，2006年 第4卷 第3期；
    （2）作者单位：扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室等。