中国水稻信息网 C.N.R.R.I.

　　世界人口的增长，可耕地面积逐渐减少和农业环境的恶化，使得世界粮食安全问题日趋严重。常规育种技术所培育的优良作物品种，为解决世界粮食问题做出了重大贡献。然而，近20年来各种作物产量均呈现徘徊局面，新育成的品种在产量潜力上没有大的突破，常规育种技术在继续提高粮食产量方面的潜力有限。基因工程技术的诞生和发展为作物进行遗传改良开辟了新途径。尤其是对一些质量性状的遗传改良，应用基因工程技术更有效。现今通过基因工程培育的抗虫、抗病、抗除草剂等作物(大豆，玉米和棉花等)品种已商品化。作物产量是一个复杂的数量性状，与植株的许多性状有关。以提高作物产量为目标的基因工程，显然要比单个质量性状的遗传改良难度大和复杂。尽管如此，随着生物技术的发展和对作物高产性状、高产机理及其相关基因的研究愈加深入，已相继建立了一些应用基因工程技术提高粮食作物产量的技术策略。例如，雄性不育系的培育和杂优利用，改良作物对病虫及环境胁迫的抗(耐)性等。代谢基因工程的发展使得人们能够通过对植物细胞代谢进行遗传修饰而改变细胞本身代谢途径，以增加目标物质的积累或合成新的化合物。光合作用、淀粉合成、氮素同化和水分利用等是形成作物产量的基础代谢。近年来，对这些代谢途径中的关键步骤和靶分子进行基因修饰以提高作物产量的研究已取得长足的进步，拓展了有关植物代谢途径及其调控机制的认识。结合我们的研究工作，着重论述应用基因工程技术调控光合作用、淀粉合成、氮素同化和水分利用等代谢途径提高作物产量的技术策略和研究现状，以及这一研究领域所面临的挑战和应用前景。

1　分子靶标的确定

　　作物产量是一个复杂农艺性状，与植株光合效率、养分吸收利用能力、物质转运速度和抵御饰的分子靶标是应用代谢基因工程培育作物高产品种首先要解决的问题。现在进行的许多植物转基因研究发现，对植物代谢进行有效调控是一道很复杂的工序。植物体内代谢不仅具有可塑性，而且各途径之间相互影响，错综复杂。因此，在确定基因修饰的分子靶标时，常需要考虑几个关键的问题。第一，某种代谢产物可能是不同分支代谢的底物，也可能是看上去并无联系的其它代谢途径酶的效应分子。这样，改变某一代谢产物水平可能会对整个代谢网络产生影响。第二，不同的酶可催化相同的反应，这使得植物能够补偿由于某个酶的遗传修饰而造成的代谢变化。或者说，即使通过基因操作使某种目标酶表达量大幅度削减也不会给代谢带来明显的影响。第三，植物可以通过甲基化作用和 RNA 干涉等机制使导入的目标基因发生完全或部分沉默，从而阻止或降低了转基因对目标代谢过程的影响。

　　依据对植物代谢途径及其调控机理的认识，通过对影响代谢产物分配的主要因素(酶基因及其调节因子)及其与作物产量关系的分析，已经确立了一些遗传修饰的分子靶标，这些基因参与淀粉合成、植物光合作用、N 素吸收和同化、水分利用等植物生理生化代谢过程。对这些分子靶标的遗传修饰已进行了许多成功的尝试，使作物产量有了一定的提高，然而尚未达到所期望的程度。

　　目前，以提高产量为直接目的的植物代谢遗传修饰主要集中在“源、流、库”能力的改良方面，即：通过对“源”组织代谢的调节以增加其对“库”组织的碳源供应能力；通过提高“源”“库”组织之间同化产物的运输能力来促进光合产物向“库”组织的转运；通过调节“库”组织的代谢来增加其对光合同化物的利用效率，进而增加特定化合物的合成和积累量。

2　淀粉合成的遗传修饰

　　淀粉是禾谷类粮食作物籽粒和薯类作物块茎或块根中的主要储藏化合物，是人类食用碳水化合物的重要来源。全世界每年来源于水稻、玉米、小麦和马铃薯的淀粉超过10₉吨。增强作物储藏器官组织中淀粉合成和积累能力一直是常规育种和基因工程育种的一个主要目标。马铃薯具有丰富的适于转化的遗传资源，较易进行基因转化和获得大量的转基因株系。因此，马铃薯已成为人们研究与产量相关代谢的生化特征以及代谢调控的模式植物。

　　淀粉主要在质体中合成。葡萄糖-6-磷酸 (G-6-P) 和葡萄糖-1-磷酸 (G-1-P) 进入质体后，在ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶 (AGPase) 催化下，G-1-P 和 ATP 形成腺苷二磷酸一葡萄糖 (ADP-glucose)。ADP-葡萄糖是淀粉合成酶的底物和淀粉合成的前体物质。早期研究中，遗传操作提高淀粉合成的首选策略是增加 ADP-葡萄糖含量。这可通过遗传修饰 AGPase 酶的特性来增加 ADP 葡萄糖的水平，也可以通过改变这种酶的已知变够效应物的水平，或者提高 ADP 葡萄糖上游代谢物—己糖磷酸酯来达到此目的。这些遗传修饰策略虽然使转基因植株的代谢发生较大改变，但其中只有对 AGPase 酶特性的遗传修饰后成功地提高了 ADP-葡萄糖含量，进而使玉米籽粒和马铃薯块茎中淀粉合成和积累增加。

　　Tjaden 等和 Loef 等研究报道，质体中腺苷酸含量的水平对淀粉合成非常重要。马铃薯块茎中质体 ATP/ADP 转运蛋白的表达与淀粉含量的变化相关，质体 ATP/ADP 转运蛋白的过量表达导致了块茎中淀粉水平的提高。然而，对该转运蛋白的反义抑制则减少了块茎中淀粉积累。进一步发现，用腺苷酸溶液培养马铃薯块茎引起细胞中腺苷酸库增加，结果最终导致块茎中淀粉合成速率的提高。腺苷酸激酶催化 ATP，AMP 和 ADP 的转化，它是维持各种腺苷酸平衡的关键酶。因此，腺苷酸激酶就成为调控腺苷酸库大小的靶标分子。

　　Regierer 等通过对质体腺苷酸激酶基因修饰而减低该酶的活性，结果导致转块茎中腺苷酸含量的增加。与非转基因的对照相比，转基因马铃薯株系块茎中淀粉含量增加了60％，块茎产量增加39％。不仅如此，转基因马铃薯块茎中一些氨基酸的含量也高于野生型马铃薯。这是迄今通过基因修饰技术使马铃薯块茎淀粉含量增加最多的一例，也是最成功的一例，并且建立了一种通过基因修饰调节参与目标代谢的辅助因子含量来增加产量的新技术策略。与常用的通过增加目标代谢产物的前体物质含量最终提高目标代谢产物产量的策略不同，该策略所修饰靶标是作为辅助因子的代谢物，这些辅助因子不仅参与目标代谢反应，还参与更多的其它生化反应。

　　Smidansky，E.D 等人近来报道了导人玉米 shrunken 2 基因的转基因小麦的分析结果。玉米 shrunken 2 基因编码葡萄糖焦磷酸化酶的一个大亚基，该亚基可降低其对负变构效应物正磷酸盐的敏感性。与野生型相比，转入该基因的小麦平均每株种子重量提高38％。这可能是由于腺苷二磷酸葡萄糖含量的改变引起的，但是也不能排除该转基因对淀粉合成其它酶或代谢的多效性的影响。这种产量提高的原因被认为是由于淀粉合成的增加所带来的库强的提高。须注意的是，这可能是基因型特异反应的一个特例。因为许多已有的试验都表明，库强的提高未能自动地增加马铃薯的产量。另一个例子是，对线粒体途径的基因修饰出乎意料地增加了块茎中淀粉的含量，转基因植株比野生型增加了45％，但并没有影响到块茎的总产量。这些研究工作预示着，如果我们能够确定适当的遗传修饰靶标，那么通过代谢基因工程提高作物产量具有良好的前景。然而，由于现有分析工具的局限性，我们对转基因效应的阐述是有限的。通常情况下，仅能够对一些关键代谢组分的专一性遗传操作效果作出评价。例如，辅因子库等可调控多种复杂的靶标，作用于代谢途径的许多方面，对上述转基因马铃薯的块茎产量提高的解释就不能明确它是腺苷酸激酶活性降低的直接结果还是间接结果。对这些因果机制的准确认识的缺陷导致我们很难评价出对同一靶标的基因操作是否能在不同作物品种及种间产生相同的效应。

3　光合作用的遗传修饰

　　提高植物光合速率是光合作用代谢途径基因修饰的一个主要目标。长期以来人们一直希望能将 C₄ 高光合特性导入 C₃ 植物以提高它们的光合效率。 C₄ 光合途径的关键酶即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)、NADP-苹果酸酶 (NADP-ME) 和丙酮酸乙磷酸双激酶 (PPDK)。将 C₄ 植物玉米的 PPDK 基因转入马铃薯中，转基因植株的 PPDK 活性比对照高5.4倍。将整个玉米的 PEPC 基因转入 C₃ 植物水稻，获得了高水平表达玉米 PEPC 的转基因水稻植株，PEPC 活性比对照高11O倍。已有的大多数转基因植株的 C₄ 酶活性，虽然高于 C₃ 对照植株，但还是远低于 C₄ 植物中的酶活性。迄今还没有所获得转移 C₄ 光合途径提高产量的例证。看来 C₄ 酶只有与 C₄ 植物特有的高效固定 CO₂ 的细胞组织及路径相结合才能发挥其高光合效能。

　　核酮糖-1，5二磷酸羧化酶加氧酶 (Rubisco) 是固定 CO₂ 反应的限速酶，改进该酶的活性尤其是对 CO₂ 的亲和性，就能提高植株的光合速率。Rubisco 由大亚基 (rbcL) 和小亚基 (rbcS) 组成。大亚基由叶绿体基因 rbcL 编码，小亚基由核基因 rbcS 编码。向日葵 (Helianthus annuus) 植物 Rubisco 的 CO₂ 亲和性最高，比烟草约高 10％。将向日葵的 rbcL 基因导入烟草叶绿体，转基因烟草叶绿体合成了由8个向日葵大亚基和8个烟草小亚基组装成的十六聚体杂种 Rubisco 。杂种 Rubisco 对 CO₂ 亲和性增加，但没有高到向日葵 Rubisco 对 CO₂ 亲和性，而且易于解体。所以这些转基因烟草植株光合效率没有提高。这可能是向日葵 Rubisco 大亚基和烟草 Rubisco 小亚基亲和性底的缘故。光合细菌 Phodospirillum rubrum 的 Rubisco 仅由一个基因 rbcM，为同源二聚体。将 rbcM 导人烟草叶绿体，转基因烟草叶绿体没有形成杂种 Rubisco，R.rubrum 的 Rubisco 则大量生成，且具有原 R.rubrum 同样的 CO₂ 亲和性。在 CO₂ 富集的条件下，转基因烟草植株才能正常生长。这些对 Rubisco 进行分子修饰的探索为光合作用改进积累了经验。随着技术的发展，有可能将向日葵编码 Rubisco 大小亚基的基因全部导入其它低光效的大田作物，使其产量提高。

　　人们还对其它参与光合作用的酶及辅助因子进行基因修饰，以提高植物的光合效率。光合作用所固定的 CO₂ 经 Calvin 循环后要迅速用于合成淀粉等碳水化合物，才能保证光合作用顺利进行。加速 Calvin 循环产物通向终产物合成，就可提高光合速率。果糖-1，6-二磷酸酶所催化的反应正是光合产物离开 Calvin 循环进入终产物合成的分支点，因此， FBPase 就成为基因修饰的分子靶标。将从蓝细菌分离的 FBPase 基因导入烟草，使其在叶绿体中表达。在含360 ppm CO₂ 空气条件下，转基因植株的光合效率和生长均明显提高，与非转基因对照相比，转基因植株的干物质和 CO₂ 固定率分别增加1.5倍和1.24倍，Rubisco 活性提高了1.2倍，Calvin 循环中间产物及碳水化合物积累均比对照增多。这是第一个关于转基因表达单个质体靶标酶提高受体植株碳同化率和生长的报道，展示了通过转基因调控光合作用提高作物产量的可行性和有效性。

4　氮同化的遗传修饰

　　植物吸收氮的多少和氮利用效率高低对产量有重要影响。结合应用转基因技术和生理生化分析，人们对植物生长发育过程中氮吸收，同化和再利用的分子控制机理的认识愈来愈深入。谷氨酰胺合成酶 (GS) ，谷氨酸合酶 (GOGAT) ，谷氨酸脱氢酶 (GDH) 是参于高等植物氮同化代谢的主要酶。GS 可分为两类，分别主要存在于光合组织的质体和根细胞的胞质中。质体 GS 由一个基因编码，胞质 GS 由一个多基因家族编码。质体 GS 同化硝酸还原和光呼吸所产生的氨，而胞质 GS 主要同化植物根系统中硝酸还原作用产生的氨。GOGAT 亦分为两类，其组成，分子量，还原特异性和功能明显差异。依赖铁氧还蛋白的 GOGAT (Fd-GOGAT) ，主要存在与叶组织细胞质体中，参与光诱导的生哩过程；NADH-GOGAT 则存在于非光合组织中，与 Gs一起同化铵。在铵的再利用中起重要作用的 GDH，亦分为两种类型，即存在于线粒体的 NADH-依赖型和存在于叶绿体的 NADPH-依赖型。用玉米重组近交群体进行 QTL 作图发现，一些控制产量的 QTL 与3个胞质 GS 基因位于相同基因组区间，说明 GS 催化的氮同化反应步骤对产量有重要贡献。现已对这几个酶进行了许多基因操作，以改进氮同化效率，提高作物产量。胞质 GS 在大豆根中超表达，总 GS 活性增加10％～30％，总氨基酸含量明显提高，但植株生长和形态没有变化。大豆胞质 GS 在莲植物中组成性超表达，叶中总 GS 活性增加50％～80％，根中 GS 活性则没变化，转基因植株发育加快，开花提前和早衰。若将大豆胞质 GS 在豆科植物根瘤中表达，植株茎和根的生物量提高2倍。烟草质体 GS 基因在大豆叶组织中超表达，导致转化叶中质体 GS 活性提高2倍，铵库量减少4倍，谷氨酸和谷氨酰胺含量增加。叶蛋白总量和表型没有改变。反义胞质 GS 基因在烟草韧皮部表达，植物体中胞质 GS 的 mRNA 减少20％～30％，根和韧皮部铵含量增加2～5倍，而质体 GS 和植株表型没有变化。超表达反义 Fd-GOGAT 基因的烟草，Fd-GOGAT 活性降低60％，引起铵毒症。小麦的胞质 GS1 基因在植株体内铵的再利用或称中起关键作用，超表达 GS1 基因的小麦叶片，GS1 活性增强，氮在体内尤其在籽粒中积累增多，根部和籽粒干重也提高，展示出小麦氮同化代谢遗传改良的良好前景。超表达各种 GDH 基因的转基因植物，不仅生长量提高，而且胁迫耐性也增强，进一步需在大田条件下，验证这些有利表型变化。可见，通过对氮同化代谢的遗传修饰提高作物产量还需作更深入的研究。

5　水分利用率的遗传修饰

　　在大多数情况下，水分利用率低是作物产量的限制因素，因此多年以来它一直是遗传改良的靶标。改良植物细胞抗渗透胁迫的能力是提高植物水分利用率的一个可行途径。现已克隆了许多抗(耐)渗透胁迫的基因，对这些基因进行遗传修饰，提高植物水分利用率也已取得一定的进展。例如，海藻糖是一种可溶性的小分子化合物，在细胞中积累可提高渗透势，对蛋白质，膜系统有很好保护作用。将酵母催化海藻糖形成的基因海藻糖-6磷酸合酶基因 TPS1 在烟草叶绿体中超表达，海藻糖含量增加了20多倍，抗渗透胁迫能力增强，水分利用率也明显提高，这为进一步应用于提高大田作物抗旱性和产量奠定了基础。应用其它一些基因进行分子操作改良植物水分胁迫耐性也取得了不少成功的经验。未来需要进行更全面更复杂的生理生化研究，建立相应的技术体系，以使在实验室获得抗胁迫的植株能继续在大田胁迫条件下保持和遗传这种改良的特征。

6　前景与展望

　　通过代谢基因工程提高作物产量的潜力还尚未被充分认识和挖掘出来。虽然已有转基因提高作物产量的例证，但是目前仍然未能确定这些代谢遗传操作提高作物产量的真正机制。由于分析工具和水平的缺陷，基于目前的生化知识对这些代谢基因修饰所产生效应的因果关系仍多限于一些推测。深入研究代谢途径之间的联系和调节规律将有望推动代谢基因工程在提高作物产量领域的广泛应用。

　　作为一个新兴研究领域，植物代谢物组学的发展将有助于建立更为合理的提高作物产量的代谢基因工程策略。将转基因技术与代谢控制分析技术结合应用于代谢工程的研究，可提供某一条途径中各具体步骤对代谢物整体分配、转运及积累所起作用的相关信息。目前，我们仍然面临遗传转化中基因型特异反应和代谢调控中存在未知因素这两个问题，这意味着我们还不能确切预测我们所确定的代谢改良目标能否通过特定基因操作而实现。为了解决植物代谢基因工程的不可预测性，我们需要建立更加先进和有效的技术，以全面分析转基因所引起的效应。近来，建立了亚细胞分离分析和其它诸如单细胞取样的微量精细分析技术。这些新技术有助于我们建立和完善有关代谢途径互作和代谢网络的概念，分析和判断哪些酶是目标代谢的关键酶以及对终产量有何重要影响，进而影响我们对代谢基因工程靶标的选择。

　　转化效率是影响应用转基因技术提高作物产量的另一个限制因素。一些主要栽培作物的遗传转化目前仍然不能够大规模、常规化和快速地进行。未来需要进一步改良应用于植物遗传转化的基因载体，使其更易快速获得大量的多基因转化体。作物产量是一个由多基因决定的复杂性状。因此，为提高作物产量，就需要同时对多个靶标进行遗传修饰。高通量技术的应用可极大地加速目标转化体(例如产量提高的转基因植株)的筛选。一旦获得产量提高的转基因株系，接着就要在大田条件下检验这些理想的目标性状能否保持稳定。经常出现的情况下是，在大田条件下，转基因株系中理想目标性状的降低甚至消失。这是未来植物转基因改良仍需解决的一个关键环节。

　　另外，调节结构基因表达的转录因子通常可控制多个代谢环节。一些研究表明，通过对转录因子的遗传修饰，可更有效地促进目标代谢产物合成和积累，这在一些次生代谢基因工程中已获得成功。例如，异源表达参与玉米花青素合成的转录因子 Lc 和 C1，提高了番茄果实中类黄酮化合物含量。我们对转录因子锌指蛋白进行分子设计，使其能特异地结合大豆基因 FAD2-1 靶序列，通过关闭该基因的表达以期提高大豆种子中油酸的含量。试验结果显示，与对照种子相比，转基因大豆种子油酸含量增加了1～1.4倍，更为意外的是种子重量提高了1％～4.3％。尽管种子重量提高幅度不是很大以及具体分子机制还不清楚，表明对转录因子进行分子操作可以提高作物产量。进一步鉴定参与基础代谢的转录因子，通过对少数具有多效性转录因子的遗传修饰，比对多个分子靶标进行遗传修饰会更有效地提高作物产量。

　　叶绿体是植物进行同化代谢的重要细胞器，约一半参与光合作用的基因由叶绿体基因组编码。叶绿体基因的表达对植物发育和细胞的生存至关重要。近年来，有关叶绿体基因组测序、基因功能鉴定以及转化技术的研究十分活跃。该领域的研究将有益于完善对光合作用等同化代谢途径及其调控网络的全面认识，有利于确定分子操作的靶标。叶绿体转化如能象核基因组转化那样简单和有效，通过代谢途径基因操作提高作物产量将更加容易。

　　随着能对代谢物图谱和代谢途径互作效应进行全方位分析的新技术的建立和应用，我们对代谢过程理解将更加深入和完善。一个自动化的技术平台将会建立和开发出来，可使人们更加经济有效地应用转基因技术对作物目标性状进行改良。我们将从对影响产量的个别靶标进行“零敲碎打”式的基因操作迈进快速，系统和高效地开展作物遗传改良的新阶段。

    注：
    （1）文章来源：辁铒技牾悫报，2005年　第5期；
    （2）作者单位：山西农业大学农业生物工程中心。

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