中国水稻信息网 C.N.R.R.I.

　　水稻是世界上最重要的禾谷类作物之一。包括大多数发展中国家在内约占总数40％的人口，其主要营养来源于水稻。但在水稻生产中，由于受稻瘟病、纹枯病、白叶枯病等病害的危害影响，严惩制约了水稻高产、稳产，从而直接威胁到人类的生存与发展。据估计，在1975～1990年的16年间由稻瘟菌引起的全球粮食损失高达1570 亿kg，年平均超过1 亿kg (Baker et al.，1997)。福建省是稻米消费大省，但福建山多地少，各地生态条件各异，导致水稻病害多且复杂。如稻瘟病菌，就发现有十几个生理小种。实践证明，培育和利用抗病品种是解决上述问题最经济而有效的方法。但由于品种选育周期较长，抗性亲本缺乏等原因，通过常规育种手段获得抗病品种相当困难。

　　20世纪80年代以来，随着生物工程技术的兴起与发展，特别是基因工程技术在改良作物抗性上的广泛应用，为培育抗病品种提供了新的手段，从而也开辟了水稻抗病育种的新时代。植物抗病转基因一直生物技术人员的研究重点，高效稳定的水稻转化系统的建立为外源基因转化水稻创造了条件。转基因技术将水稻基因库中不具有的抗病基因导入水稻，实现了传统育种方法无法实现的基因重组，大大提高了育种水平 (邱小辉等，1998)。

1 植物系统获得性抗性与广谱抗病性

　　在长期进化过程中，为了抵抗病原微生物的侵害，植物逐渐形成了一系列复杂而有效的保护机制。植物被非亲和病原产生枯斑的亲和病原侵染后，非侵染部位在一段较长时期内都保持着对这种病原及一些其它病原的增强抗性，即系统获得性抗性 (systemic acquired resistance，SAR)。植物系统获得性抗性是植物抵抗病原菌侵袭的复杂防御网络之一 (Uknes et al.，1992；Ryals et al.，1996；何祖华，2001)。它是通过植物抗病基因 (R) 与病原微生物的无毒基因 (avr) 相互识别和相互作用来实现的。R 基因和 avr 基因识别后，引发过敏反应，同时通过信号传导途径诱导一系列抗病防卫反应基因表达，产生系统获得抗性 (systemic acquired resistance，SAR)。植物产生 SAR 后，能在较长时间内保持对多种病原菌的增强抗性。抗病防卫反应中表达的基因主要是编码病程相关蛋白 (pathogenesis-related proteins，PRs) 和植保素合成相关酶基因。PR 蛋白在植物抗病性和系统获得抗性中起重要作用，有些 PR 蛋白在体外就有抗菌活性。已经克隆并鉴定了水稻中的几类 PR 蛋白基因，其中包括能降解真菌细胞壁的 PR-3 (编码几丁质酶)和 PR-2 (编码 B-1,3-葡聚糖酶)，以及有抗菌作用的类奇甜蛋白 (thaumatin-like proteins，TLP，属 PR-5 类)等。通过转入自身或其它植物的防卫反应相关基因来提高水稻抗病性，已有大量的尝试。

　　SAR 的一个重要特点就是它的抗性的广谱性，一种病原诱导的 SAR 往往对多种病毒、细菌及真菌病原表现出 SAR (Kessmann et al.，1994)。因此，通过调节 SAR 反应来获得广谱抗病性，是一条很有潜力的途径。

　　利用基因工程技术向敏感植物导入单一的抗病基因或信号转导途径中能激发植物防御机制的基因，可以使植物的防卫反应强度提高或反应速度加快，增强植物的抗性水平，这就是植物广谱抗病基因工程育种的理论基础。

2 植物基因工程育种的广谱抗病基因

　　用于植物基因工程育种的广谱抗病基因主要有 R 基因、过敏反应 (HR) 诱导的基因和 SAR 的组成型表达基因 (窦道龙等，2002)。

2.1 R 基因

　　目前，已经在不同植物中鉴定了大约20余种 R 基因，按其结构可分为5类 (Ellis et al.，2000)。在品种间或近缘种之间进行这些 R 基因转移可介导产生抗病性。

2.2 过敏反应 (HR) 诱导的基因

　　植物对病原菌感染的反应最初表现为感染部位细胞迅速而局部性的死亡，称过敏反应 (hypersensitive response，简称HR)。HR 是植物细胞的一种程序性死亡 (programmed cell death，PCD)。通过感染部位的细胞的主动死亡，致使局部组织脱水，从而切断病原菌的营养供给，使病原菌限制在局部感染区不再扩展。HR 的产生主要有两种情况：一是由 R 基因和相应病原菌的 avr 基因产物互作诱导产生；二是由植物病原细菌在非寄主植物上诱导产生，后者主要由植物病原细菌中的 hrp (hypersensitive response and pathogenesis) 基因家族决定。主要的过敏反应 (HR) 诱导的基因有无毒基因 (avr)、Hrp 基因、细菌视蛋白基因 (Bacterio-opsin gene，简称 bO 基因)

2.2.1 无毒基因 (avr)

　　根据“基因对基因”(gene-for-gene) 理论，植物通过 R 基因与病原菌的 avr 基因识别，才能激发植物的抗病反应，理论上分离病原菌的 avr 基因，使其在含有相应 R 基因的植株中表达，将给这类植物赋予对其它病原菌的广谱抗性，病毒外壳蛋白基因工程的成功利用也从侧面说明无毒基因在防卫反应中的功能。目前，已经分离出数种细菌和真菌的无毒基因，其中应用比较成功的有 hrmA、avr9 等。

2.2.2 Hrp基因

　　Hrp 基因是一种特殊类型的 avr，其产物Harpins 是决定植物病原细菌在非寄主上诱导 HR 的蛋白因子。转基因拟南芥和马铃薯的抗病性增强，研究表明 Harpins 诱导的 SAR 与植物的 SA 积累关系密切。

2.2.3 细菌视蛋白基因 (Bacterio-opsin gene，简称 bO 基因)

　　人们在细菌 (Halobacterium hatobiurn) 中发现一种由 bO 基因所编码的质子泵蛋白可以引发植物产生类似于受病原菌侵染时所产生的反应(包括 HR )。表达 bO 基因的转基因烟草对一些病毒的抗病性得到提高，并对烟草野火病菌产生完全抗性。转基因植物积累了高水平的 SA，而 SA 是植物产生系统获得性抗性 (SAR) 过程的主要信号分子。但在转基因马铃薯中，bO 基因的表达使植株显示出与自发产生坏死侵蚀斑的突变体类似的表型，该种植株对病毒和细菌病害的抗性降低，但对真菌病害抗性增强。

2.3 SAR 的组成型表达基因

　　SAR 的激活能导致植物广谱抗病性的形成，许多生物和非生物因素可以诱导 SAR 的形成，目前研究较多的是 SA 及其结构类似物、SAR 信号转导途径中的功能基因。

2.3.1 SA相关基因

　　SA 是植物抗病反应的重要信号分子，在植物的 SAR 信号转导和抗病反应中起着关键的作用。在高等植物中，SA 是反式一肉桂酸经正羟基香豆酸或 BA 中间物合成的。由于 SA 是诱导 BAR 产生的有效物质，已筛选出它的一些类似物，如 2,6-二氯异烟酸 (INA) 和苯丙咪唑 (BTH) 可以诱导烟草、小麦和水稻等植物产生强烈的 SAR。在田间可以提高60％～95％的对不同病原抗性。Verberne 等(2000)通过提高植物内源 SA 量的方法成功地提高了植物的整体抗病水平。他们分别从大肠杆菌和加单孢杆菌中克隆了 SA 合成过程中关键酶 isochorismate synthase 和 isochorismate pyruvatelyase 的基因，并导入了烟草，使得转基因植株体内的 SA 水平比对照提高 500～1000 倍，同时也提高了烟草对 TMV 和 Oidium lycopersicon 的抗性。

2.3.2 SAR 信号转导途径中的功能基因

　　SAR 信号转导途径中的功能基因主要是编码病程相关蛋白 (pathogenesis-related proteins，PRs) 和植保素合成相关酶基因。

3 水稻广谱抗病基因工程

3.1 几丁质酶基因工程

　　几丁质酶基因是一种 PR 蛋白基因，国内许多学者将其导入水稻中。Nishizawa 等(1999)将水稻几丁质酶基因 Cht-2 和 Cht-3 分别转入粳稻 Nippobare 和 Koshihikari，发现转基因植株中 Cht-2 的产物在细胞内积累，而 Cht-3 的在细胞外积累。转 Cht-2 或 Cht-3 基因植株的 R₀ 及 R₁ 代对稻瘟菌致病小种的抗性显著提高。Lin 等(1995)和 Datta 等(2000)将从水稻中克隆的 I 类几丁质酶基因 Chill转入籼稻获得转基因植株。与对照相比，转基因植株对 R.solani 表现出一定抗性。Datta 等(2001)将从受 R.solani 侵染的水稻品种 IR58 中分离的一个几丁质酶基因 RC-7 基因转入 IR72 等品系后，转基因植株显著提高了对纹枯病菌的抗性。覃宏涛等(2000)将哈茨木霉几丁质酶基因，袁红旭等(2004)将碱性几丁质酶基因 (RC24) 导入水稻中，转基因植株也表现出对纹枯病菌的抗性。

　　几丁质酶和 β-1,3-葡聚糖酶在离体条件下对真菌细胞壁的降解具有协同作用。Feng (1999)等将水稻碱性几丁质酶基因 RC24 和苜蓿 β-1,3-葡聚糖酶基因 β-1,3-Glu 同时导入水稻，部分 R₁ 代转基因植株对广东省稻瘟菌5个代表菌株表现出不同程度的抗性提高。

　　陈红等(2003)从水稻叶片分离到的一种几丁质酶活力较高的菌株 X2-23，它对水稻纹枯病、稻瘟病、恶苗病，小麦赤霉病，油菜菌核病等十多种真菌病原菌以及水稻白叶枯病菌等细菌病原菌具有不同程度的抑制作用。

3.2 植保素基因工程

　　植保素 (phytoalexin，PA) 是植物受病原物侵染后产生的低分子量抗菌化合物，在植物抗病反应中起着重要的作用。由于 PA 具有侵染可诱导性和体外抗菌活性，它的合成和累积被认为可能是植物的一种重要抗病机制。植保素合成途径中一些相关合成酶基因已被克隆，这使得从分子水平上调节植保素合成来增强抗病性成为可能并初见成效。 Trans-reseratrol 是植物体内普遍存在的一类植保素，1,2-二苯乙烯 (stilbene) 合成酶是其合成途径中的关键酶之一。将葡萄的该酶基因在其自身启动子驱动下转入水稻，提高了对稻瘟病的抗性 (Stark-Lorenzen et al.，1997) 和白叶枯病的抗性(田文忠等，1998)。

3.3 白叶枯病抗病基因工程

　　白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。研究发现，水稻中存在对 Xoo 多小种高度抗性的基因，包括已经克隆的 Xa21 基因。Xa21 基因由野生种长药野生稻 (Oryzaelongistaminata) 引入，带有 Xa21 位点的品种能抗多数己知的 Xoo 小种。转 Xa21 基因的水稻植株对来自8个国家的29个株系都表现抗性，且转基因株和供体植株的抗性谱相同，表明单基因能控制多小种病害。我国科学家已将 Xa21 基因转入生产中广泛推广的籼稻优良品种或不同的杂交系，用以生产抗白叶枯病的杂交稻。转基因后代能稳定遗传，在田间对 Xoo 表现出良好的抗性 (Zhai et al.，2000)。

3.4 抗菌肽基因工程

　　抗菌肽是植物及其它生物产生的一类小分子量肽。将编码抗菌肽的基因转入植物可以提高对细菌和真菌病害的抗性 (Mourgues et al.，1998)。Huang 等(1996)将 cecropin 合成酶基因转入水稻中百4号和京引119两个品系，部分转基因植株对细菌性条斑病 (Xanthomonas oryza pv.oryzicola) 和白叶枯病的抗性显著提高。

　　NPR1 是调节拟南芥中 SAR 信号传导途径的一个关键基因，与参与动物免疫反应的转录因子 NF-KB 羧基末端的锚蛋白重复单位结构域 (ankyin-repeat domain) 有相似的功能域，组成型表达 NPR1 基因的拟南芥植株表现出对丁香假单胞杆菌 (Pseudomonassyringae) 和寄生霜霉菌 (Peronospom-parasitica) 的广谱抗性 (Cao et al.，1998)。最近，研究表明水稻中也存在类似 NPR1 介导的信号传导途径，组成型表达 NPR1 基因的水稻植株对白叶枯病 (Chem et al.，2001) 和稻瘟病都表现抗性 (Rommens and Kishore，2000)。

　　Wu 等(1995)将葡萄糖氧化酶基因转入马铃薯中，研究结果表明，植物对由细菌引起的软腐病和真菌引起的晚疫病的抗菌性有明显提高。在番茄中转入 Pto 基因，转基因植株表现出对多种病原具有广谱抗性 (Tang et al.，1999)。Honee 等(1998)利用马铃薯 prp-1 启动子指导下的 avr 9 基因导入 cf-9 基因型番茄，转基因番茄对 C.fulvum 和 Oidium lycoperdicum 等多种真菌产生抗性。Verberne 等(2000)通过提高植物内源 SA (水杨酸)量的方法成功地提高了植物的整体抗病水平。他们分别从大肠杆菌和假单孢杆菌中克隆了 SA 合成过程中关键酶 isochorismate synthase 和 isochorismate pyruvate lyase 的基因，并导入了烟草，使得转基因植株体内的 SA 水平比对照提高 500～1000 倍，同时也提高了烟草对 TMV 和 Oidum lycopersocon 的抗性。

4 问题与展望

　　SAR 是植物完整的疾病抗性系统中的一个组成部分，是植物对多种病原体(细菌、真菌及病毒)非特异性的，持久的抗性，对植物的生长发育有重要意义，多年来一直是当代植物防病战略的研究焦点，对 SAR 的深入研究可少用乃至不用化学合成的农药。通过基因工程的方法将广谱抗病基因导入水稻中，选育出具有广谱抗病的水稻品种，这对改善水稻品质，保护环境以及对生物防治都将产生深远的影响。

    注：
    （1）文章来源：分子植物育种，2005年第3卷第6期；
    （2）作者单位：福建省农业科学院水稻研究所。

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