作者：张红志 等

来源：见觚钿

发布时间：2005-7-29 15:57:08

　　植物在长期进化过程中，形成了复杂的防御病原物侵染的抗性机制，这一机制由不同水平的多个抗性途径交叉、重叠组成，使得植物抗病性具有多种表现形式。典型的抗性形式包括基础抗性(basic resistance)、诱导抗(inducedresistance)和由抗病基因(resistance gene，R)决定的抗性等。基础抗性是指植物与生俱有的对病原物表现出的本底抗性。丧失基础抗性的植物对病原物表现出比普通感病性更强的感病性，即超感病性(supersusceptibility)。诱导抗性是指植物由于外源生物或非生物因子的作用，激活植物自身防御体系，从而产生对病原物的系统抗性的现象。其中研究较透彻的是系统获得抗(systemic acquired resistance，SAR)和诱导系统抗性(induced systemic resistance，ISR)。SAR是指植物由坏死性病原物(necrotizing pathogen)侵染或者局部组织经化学诱导物处理，导致植株未侵染(处理)部位产生对后续多种病原物侵染表现出的抗性。这种抗性具有系统、持久、广谱的特点。ISR则是指由部分非致病性根围细菌定殖植物根部，诱发植物产生的整株系统性的抗性。水杨酸(salicylic acid，SA)是诱发SAR产生的关键信号分子之一。而茉莉酸jasmonic acid，JA)和乙烯则为诱发ISR产生的关键信号分子。
　　不同形式的抗病性信号传导途径有区别，也有重叠和交叉。其中的交叉点将是调节植物整体抗病性的重要因子。 近年来的研究结果表明，NPRl(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)就是其中之一。NPRl不仅对SAR和ISR起 核心调控作用，而且也是基础抗性以及由抗病基因(resistance gene，R)决定的抗性的重要调控因子。对NPRl调控抗性的机制的认识将促进人们对植物抗病机制的更深入理解。近年来，对NPRl作用机理方面的研究已取得重大进展，本文重点对此进行综述。

１ NPR1 的克隆
　　NPRl基因最早从模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆得到，在很多重要的经济作物，如花椰菜、甘蓝、烟 草、番茄、马铃薯、小麦、玉米等中存在其同源基因，在烟草和番茄中分离到其eDNA克隆。
　　Dong研究小组于1997年构建了PR-2基因启动子与uidA(GUS)报告基因开放阅读框(open reading flame，ORF)的嵌合基因，以其转基因拟南芥为材料，筛选获取了SA类似物 2,6-二氯异烟酸(2，6-dichloroisonieotinic acid，INA)不能诱发报告基因及PR基因表达，不表现SAR的nprl突变株，并采用图位法(map-based strategy)克隆了该基因。同年，NPRl等位基因突变niml(noninducibleimmunity)sail(salicylic acid-insensitive)及其基因分别被Ryals研究小组Klessig研究小组分离和克隆。
　　最近，Liu等(2005)发现，在拟南芥基因组中存在5个氨基酸序列类似NPRl的基因，分别命名为(NPR2-NPR6)，并系统研究了NPR4的功能。结果表明，与NPR1一样，NPR4 也在植物抗病性中起重要作用。

2 NPR1蛋白的结构

　　 　　拟南芥NPR1基因位于1号染色体，含有4个外显子和3个内含子，其启动子区域有一个W-box序列，可与WRKY转录因子结合，从而调控NPRl基因的转录。
　　NPRl蛋白包含593个氨基酸，其中包括17个半胱氨酸，分子量约66kD。其序列中部含有锚蛋白重复结构域(ankyrin repeats)，该结构域与哺乳动物ankyfin 3基因、信号传导因子I_kB的α亚组(调控Rel家族转录因子NF-_kB的活性)具有显著同源性。但植物NPR1介导的抗病信号传导途径与哺乳动物NF-_kB介导的信号传导途径是否相似尚有待进一步的研究验证。

3 NPR1在植物抗病性中的关键作用

　　植物防御系统是一个错综复杂的系统。已有研究结果表明，NPR1是由各类已知抗病信号传导途径组成的信号传导网络中的关键交叉点，参与各种类型抗病性的调控。

3．1 NPR1在SAR中的作用

　　NPR1的缺失导致PR(pathogenesis-related)基因不表达，以及植株SAR抗性的丧失。将野生型NPR1基因转入npr1突变株，则完全恢复SA或INA诱导突变株产生的SAR反应。NPR1转基因植株组成性(constitutively)表现SAR。这些结果清楚说明NPRl在SAR中的关键作用。

3．2 NPR1在ISR中的作用

　　荷兰van Loon研究小组最早研究发现NPRl在ISR中的作用。他们发现，在nprl突变株中，ISR诱导菌Pseudomonas fluorescens不能诱发产生ISR。该结果以及后来的研究结果说明NPRl不仅在sA介导的SAR，而且在茉莉酸介导的ISR产生中起重要调控作用。

3．3 NPRl在基础抗性中的作用

　　NPRl在植株体内组成性表达。NPRl的缺失导致植物对多种真菌、细菌病原物的侵染表现更高的敏感性和更严重的病害症状，表明NPRl在基础抗性产生中起重要作用。

3．4 NPR1在R基因决定的抗性中的作用

　　Ekengren等利用基因沉默方法分析了NPRl在Pto决定的抗性中的作用，发现，NPRl及其互作转录因子TGAla和TGA2.2的基因沉默使番茄植株丧失了Pto决定的对 Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000(PstDC3000)的抗性，表现出病害症状。证明NPRl可能在Pto决定的抗性中起重要作用。另外，我们发现，NPRl的时序表达与番茄抗病基 因Cf决定的过敏性坏死和抗性产生和发展的时序呈密切正相关，说明NPR1也可能在cf基因决定的抗性中起作用。
需要指出的是，NPR1并非在所有R基因决定的抗性中都起调控作用。至少，在SNCl和ssi4基因决定的抗性中不起重要调控作用。

4 NPR1的作用机理

由于NPR1在多种形式植物抗病性中的关键作用，其作用机理，尤其在分子水平的作用机理方面的研究受到高度重视，并已取得重大进展。

4．1 NPR1的表达水平与其调控植物抗性之间的关系

　　因为NPR1组成性表达，所以起先人们怀疑NPRl可能不在转录水平调控植物抗性。然而，Yu等研究证明，一些WRKY转录因子(如AtWKRYl8等)可与NPR1基因启动子区域的W-box序列相结合，正向调节NPR1表达，从而激活下游因子，增强PR基因的表达。若将W-box序列突变，使其不能与WRKY识别、结合，则导致启动子不能激活下游防卫基因的表达，从而无法表现抗性。因此，NPRl可能在转录水平调控植物抗性。我们发现，番茄抗病基因cf决定的过敏性坏死反应和抗性产生时NPRl的表达显著增强，但 NPR1是否在转录水平调控cf基因决定的抗性尚有待进一步研究的证实。

4．2 NPR1的存在形式、部位与其调控植物抗性之间的关系

　　Dong研究小组发现，NPR1蛋白可以以单体或者寡聚体的形式存在于细胞质或细胞核中。其存在形式决定于植株细胞内的氧化还原势。在正常状态下，NPR1通过分子间二硫键形成寡聚体，存在于细胞质中。SAR反应中，SA的积累使细胞内还原势增加，NPRl寡聚体中的二硫键被还原形成单体，并通过位于NPR1蛋白C-末端的核定位序列(nuclearlocalization signal，NLS)的作用，使NPR1单体在细胞核内积累，从而激活下游防卫基因表达。磷酸戊糖途径是细胞还原势的主要来源，如果阻塞该途径，则NPRl单体数量和PR基因的表达均显著减少。NPR1蛋白的82和216号半胱氨酸残基参与分子间二硫键的形成，这两个残基的突变导致NPRl单体化和突变蛋白的核内定位，以及防卫基因的表达。因此，NPR1蛋白还原成单体及其在细胞核内的积累是诱导SA介导的PR基因表达和SAR表现的充分必要条件。

4．3 NPR1激活豫基因表达的机理

4．3．1 TGA转录因子在NPR1介导的PR基因表达和抗性产生中的作用：最近几年关于NPR1作用机理研究的重大进展之一是，研究明确了NPR1通过与TGA转录因子的互作来调控PR基因表达和抗性的产生。TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域(basic DNA-binding domain)和亮氨酸拉链结构域(1eucine zipper domain)，能与as-1(activation sequence1)顺式作用元件相结合，调控含as-1基因表达的bZlP类转录因子。as-1结合位点长约20～22bp，两端各有TGACG保守序列。最早发现于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaicvirus，CaMV)35S启动子，以及农杆菌(Agrobocteriumtumefaciens)章鱼碱合酶(octopine synthase，ocs)和胭脂氨酸合酶(nopaline synthase，nos)基因启动子中。后来发现在许多植物防卫反应相关基因，包括sA和甲基茉莉酸信号传导基因．及一些PR基因的启动子中也包含该元件。因此，调控含as-1基因表达的TGA转录因子自然也在植物抗病反应中起调节作用。近年来研究发现，一些TGA对防卫反应相关基因表达的调节依赖于NPRl的存在。反之，NPRl对防卫反应相关基因表达的调节也依赖于TGA转录因子的存在。总之，NPRl与TGA转录因子相互作用共同协调对防卫反应基因的表达和抗性的调控。
　　 植物TGA基因以基因家族方式存在。比如，拟南芥TGA基因至少有10个，目前已克隆了7个(TGAl至TGA7).最近研究结果表明，不同TGA成员主要通过以下两种方式与NPRl互作，从而调控PR基因表达和抗性的产生。
　　(1)TGA与NPRl直接结合，正向调控PR基因表达和抗性的产生。两者结合的强度，保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。典型代表是TGA2，TGA3，TGA5和 TGA6等。
　　(2)TGA在细胞内有类似NPRl的单体-寡聚体的变化。自然状态下，TGA在两个保守的半胱氨酸残基之间形成二硫键，不与NPR1相结合。SA处理导致二硫键还原，还原态TGA可与核内NPR1单体互作，从而增强PR基因的表达，提高抗性。典型代表是TGAl和TGA4。
4.3.2 与NPR1互作共同参与PR基因表达和抗性调控的其它因子：除TGA转录因子外，NPR1可能还与某些WRKY转录因子互作，协同调控PR基因的表达。某些WRKY转录因子，如AtWKRY62等，其表达依赖于NPR1，而且存在与NPR1蛋白的互作，进而调节下游信号传导。
　　此外，Dong研究小组分离克隆了SNl1(suppressor of nprl-1，inducible 1)。研究表明，SNl1是PR基因表达和SAR的负调控因子；NPR1可能以间接作用方式通过抑制SNl1来激活PR基因表达和SAR。两者之间的相互作用机制有待进一步深入研究。

4．4 NPR1在调节和平衡不同抗病信号传导途径中的作用

　　目前已知的抗病信号传导途径主要包括sA，乙烯和茉莉酸介导的途径，它们参与不同类型抗性的调控。如SAR主要通过SA介导的途径，而ISR则通过乙烯和茉莉酸介导的途径来激活产生。那么，在一个植株个体内如何平衡和调节各类不同信号途径诱发的防卫反应基因表达和抗性产生?研究结果表明，不同抗病信号传导途径之间存在对话(cross-talk)，有的相互增强，如乙烯和茉莉酸介导的途径，有的则互相抑制，如SA介导的途径与乙烯和茉莉酸介导的途径。不同信号传导途径之间的交叉点是平衡和调节由这些信号传导途径诱发的防卫基因表达和抗性产生的关键因子。近年研究表明，NPRl就是这样的关键因子之一。
　　NPR1既是SA，又是乙烯和茉莉酸介导的抗病信号传导途径的关键因子，是这些信号传导途径的交叉点。这些信号传导途径的强弱可通过NPR1这个节点来协调和平衡。Spoel等(2003)发现，接种PstDC3000后，NahG转基因植株不能积累SA，但其茉莉酸含量增加25倍，同时茉莉酸信号传导基因的表达也显著增强。说明在野生型植株中，SA的存在及其信号传导途径的激活抑制了茉莉酸信号传导途径。而且，他们发现，在npr1突变株中，这种抑制作用显著减弱，表明NPR1在sA信号传导途径抑制茉莉酸信号传导途径中的关键作用。值得注意的是，与NPR1对单一SA信号传导途径的正向调控作用在细胞核内进行不同，NPR1对SA和茉莉酸信号传导途径的这种协调作用在细胞质内进行。
　　另外，Li等(2004)研究发现，转录因子WRKY70也在sA抑制茉莉酸信号传导途径中起重要作用，而且这种作用的产生依赖于NPR1的存在。
　　最近，NPR1类似基因NPR4对sA和茉莉酸信号传导途径的协调作用也得到了初步研究。结果发现，在npr4突变株中，两类信号传导途径标志基因的表达均受到抑制。说明与NPR1不同，NPR4对这两类信号传导途径均起正向调控作用。
　　总之，NPR1对各种信号传导途径的协调非常精细。NPR1与WRKYTO，及其类似基因NPR4是各自单独还是通过直接相互作用，来协同调节和平衡sA和茉莉酸信号传导途径尚有待进一步深入研究。

5 NPR1在植物保护中的应用前景

　　如前所述，NPR1是植物抗病性的关键调节基因。在许多重要经济作物中存在其同源基因。因此，NPR1介导的抗性途径可能是多种植物共同保守的途径。因此可以设想，通过遗传工程将NPR1应用于植物保护，使植物避免多种病害的发生应有光明的前景。事实上，NPR1转基因拟南芥和水稻已分别被构建。对这些转基因植株的抗病性分析结果表明，NPR1无论在单子叶还是双子叶植株中的过量表达均使植株组成性表现对多种病原物的广谱持久抗性。这些研究结果显示了NPR1通过遗传工程在减少植物病害发生方面的应用潜力。比如，采用只有病原物侵染才特异性诱导表达的启动子，带动NPR1的表达，并构建转 基因植株。该植株在而且只有在病原物侵染时才诱导NPRl的表达，激活防卫反应，诱发抗性的产生。

6 展望

　　近几年来，NPR1的作用机理已有一些重要的发现，如NPR1存在的形式、细胞部位与其抗性调控作用的关系，TGA转录因子等NPR1下游信号传导因子的鉴定等。但随着认识的深入，仍有许多疑问展现在研究者面前，例如：sA通过改变细胞内氧化还原状态激活NPR1，那么其它抗性信号分子如茉莉酸和乙烯又是如何激活NPR1？
　　NPR1如何在植株内调节和平衡sA、茉莉酸和乙烯等不同信号传导途径?
　　不同TGA和WKRY转录因子成员如何互相协调调控NPR1信号传导途径?
　　 通过生化和遗传等多种方法的结合，获取更多NPR1的直接互作因子，将有助于回答以上问题，增进对NPR1作用 机理的认识，从而增进对植物抗病机制的理解。

注：
　　（1）文章来源：生物工程学报，2005年第21卷第4期；
　　（2）作者单位：浙江大学。