作物许多重要农艺性状，如产量、品质、生育期等均属于数量性状，对控制数量性状的基因 (Quantitative trait loci,QTL) 开展研究已成为现代遗传学的热点之一。QTL 的鉴定和克隆不仅有利于从分子水平上阐明这些性状的发育和形成机理，而且对于有效开展数量性状分子育种，进一步提高作物品种的产量、品质和抗性水平具有重要意义。近年来，作物数量性状基因克隆取得了重要突破，一批控制复杂农艺性状的 QTL 已被成功分离。随着植物基因组研究的日益广泛和深入，作物 QTL 的图位克隆技术将有新的发展。

1 数量性状基因克隆基本思路

　　数量性状由多基因控制，并受环境条件影响，其表型变异是连续的，一般只能通过统计分析方法来确定其遗传座位。从本质上看，QTL 的定位研究只是以一定概率标准说明在基因组的某些区段可能存在影响某个数量性状的 QTL，至于这些 QTL 包含多少个基因，包含什么基因，以及它们如何作用于目标性状，则需通过遗传学的方法进一步去鉴定。

　　在遗传上，QTL 与控制质量性状的基因是一样的，都能够通过遗传重组进行分离，差异只是在遗传效应大小方面，而且同一座位既是一个 QTL，也可能是一个主基因，这取决于所考察的等位基因。因此，QTL 克隆的基本思路与控制质量性状的主基因是相似的，即首先将初步定位的 QTL 界定到一个很小的基因组区域，然后提名候选基因，进行序列分析，最后进行功能验证。由于一个数量性状的分离通常由多个 QTL 共同决定，每一个的贡献较小，且这些 QTL 常常紧密连锁在一起，因此 QTL克隆的关键问题是如何将控制所研究性状的多个 QTL 分解为单个孟德尔因子。近年来在水稻、玉米和番茄上进行的 QTL 分离和克隆的开创性工作，为解决这一问题提供了有效途径和具体方法。

2 作物数量性状基因图位克隆进展

2.1 已被成功克隆的作物 QTL

　　目前已报道被成功克隆的作物 QTL 有9个(表1)。其中水稻上的 Hd1、Hd6、Hd3 和 Ehd1 都与抽穗期有关；玉米的 tb1 和 Dwarf8 分别控制株型和生育期；而番茄的 Brix9-2-5、fw2.2 和 Ovate 则分别作用于糖含量、果重和果形。从表1可以看出，用于作物 QTL 克隆的方法有3种，除 tb1 和 Dwarf8 分别通过转座子标签法和候选基因法被克隆外，其他 QTL 的克隆均采用图位法，可见目前图位克隆仍是作物 QTL 克隆的主要方法。

2.2 作物 QTL 图位克隆的基本原理和方法

　　图位克隆方法的主要原理是根据基因在图谱上的相对位置来克隆基因。目前利用该方法已经在多种生物中克隆到大量的主基因。在图位克隆中，QTL 的准确位置较难限定，但一旦控制目标性状的某个 QTL 被确定为单个孟德尔因子后，下一步的工作就与主基因没有多大区别。根据已有的文献报道，作物 QTL 图位克隆的基本程序可概括如下：首先利用初级作图群体对所研究的数量性状进行 QTL 初步定位，然后结合回交和分子标记辅助选择，对目标 QTL 进行前景选择，同时进行背景的负向选择，培育目标 QTL 的近等基因系 (Near-isogenic lines，NILs)、染色体片段替换系 (Chromosome segment substitute lines，CSSLs) 或导入系 (Introgressive lines，ILs)，再利用这些材料构建较大的次级分离群体，在目标区域设计特异性引物，对 QTL 进行精细定位，从而将目标 QTL 范围缩小到一个很小的基因组区域。在此基础上，可用染色体步移或着陆的方法构建覆盖目标区域的克隆重叠群，鉴定出该座位上的候选基因，并对候选基因序列特性和编码产物进行分析和预测；最后通过表达分析和互补测验等进行功能验证。下面以 Hd1 为例，说明目前作物 QTL 克隆的具体步骤和方法。

　　水稻中共有15个 QTL 与抽穗期有关，遗传作图将 Hd1 初步定位在控制光周期反应的 Se1 基因所在区域，因此认为 Hd1 可能是 Se1 基因座的等位基因，为了证实这一推测，Yano 等采用图位克隆法克隆了 Hd1。

　　第一步，Hd1 的精细定位与覆盖目标区域重叠群的构建：首先从籼稻品种 Nipponbare 和粳稻品种 Kassalath 构建的 BC₃F₂ (Nipponbare 作轮回亲本) 群体中选择携带杂合 Hd1 区域，其遗传背景主要为 Nipponbare 的植株进行自交，发展一个由9000个个体组成的分离群体 (BC₃F₃)；根据表型选择1505个早熟极端个体 (在 Hd1 区域带有纯合的 Kassalath 等位基因)组成301个基因池，检测到 Hd1 与2个侧翼标记 R1679 和 P130 间的重组株分别为9个和2个，进一步对这11个重组株用2个 RFLP 标记 (C235 和 S2539) 和一个 CAPS 标记 (S20481) 进行分析，将 Hd1 定位在 S20481 和 P130 之间；用 Hd1 两侧标记筛选 YAC 库 (RGP 用于构建物理图谱的基因组文库)，发现2个克隆 Y4836 和 Y3955 包含3个侧翼标记 (C235、S20481 和 S2539)，对 Y4836 克隆进行末端克隆，RFLP 分析表明，其右末端 Y4836R 与 P130 共分离；继续用 S20481、S2539 和 Y4836R 筛选 Nipponbare 基因组 PAC 文库，获得2个 PAC 克隆，其中 P0038C5 包括了 S20481、S2539 和 Y4836R 三个标记序列，因此覆盖了 Hd1 区域；进一步对 P0038C5 测序，根据 S20481 和 Y4836R 的位置，确定一个 26 kb 的范围为 Hd1 的候选基因区域；利用候选基因区域序列资料设计了9个 CAPS 标记，并对这些标记间及与 Hd1 之间的重组情况进行分析，最终将 Hd1 限定在一个 12 kb 的区域。

　　第二步，Hd1 候选基因的序列分析和功能预测：用 Genscan 软件分析候选基因区域的基因组序列，预测该区域有2个可能的候选基因。BLAST 搜索非富余 DNA (Nonredundant DNA) 数据库显示，其中第一个与拟南芥的 CONSTANS (CO) 基因有很高相似性，而第二个就是 S2539，一种过氧化物酶的序列，考虑到 CO 与拟南芥的光周期反应有关，因此初步选择第一个基因为候选基因进行下一步序列分析；与 Nipponbare 相比，Kassalath 在候选基因序列的第一个外显子中存在4个单碱基替换、1个双碱基替换、1个 36bp 碱基插入和1个 33bp 碱基缺失，而在第二个外显子中有2个单碱基替换和1个双碱基缺失；对 se1 (水稻控制光周期反应的1个主基因) 突变体 HS66 和 HS110 及其原始野生型品种 Ginbouzu 在 Hd1 第一候选基因区域的序列进行比较，也发现突变体 HS66 第一外显子中有1个43个碱基的缺失，突变体 HS110 内含子中有1个 433bp 的碱基插入，这些结果表明 Hd1 与 Se1 是等位的。对水稻的 Hd1 和拟南芥的 CO 进行序列比对，发现在锌指域有59％的一致性，而 C 端区一致性达79％；从序列分析可知，水稻 Hd1 由2个外显子组成，编码一个395个氨基酸组成的蛋白质，是拟南芥 CO 基因家族的成员之一。Kassalath 等位基因由于第二个外显子中的缺失形成提早终止密码子，结果形成没有 C 端的蛋白产物，导致功能的缺失。

　　第三步，Hd1 候选基因的功能验证：关键的实验是转基因功能互补测定。将来自 Nipponbare 的一个包括 Hd1 候选基因的 7.1 kb DNA 片段转移到一个 Nipponbare 的近等基因系中，该受体在 Hd1、Hd2 座位含有纯合的 Kassalath 等位基因，表现对光周期钝感，结果带有 7.1 kb DNA 片段的转化植株在短日照条件下较携带载体序列的转化植株和受体提早抽穗，对转化植株后代表型分析也证明了包括 Hd1 候选基因的 7.1 kb DNA 片段具有光周期反应敏感的功能。RT-PCR 分析显示，Hd1 的表达受光周期转换的影响并不大，这说明该基因的作用可能是通过影响那些受光周期直接调控的基因的表达来实现的。

2.3 作物 QTL 图位克隆方法的不足

　　目前所有作物 QTL 的克隆基本上都是按照以上的方法和步骤进行的，整个过程涉及遗传图谱、物理图谱的构建；基因组文库或 cDNA 文库的建立与筛选；近等基因系等群体的选育以及 DNA 测序、基因表达分析和互补测验等。这些环节的工作是比较复杂的，所花费的人力、物力和时间也是很多。 Tanksley 实验室从20世纪80年代末开始研究番茄果实重量的数量遗传规律，1996年把 fw2.2 定位到第2染色体的约 150 kb 的区域，在2000年完成了克隆工作，前后花了10多年的时间；以色列的 Zamir 研究小组在1995年把1个控制番茄糖度的 QTL Brix9-2-5 定位在第9染色体上大约 9 cM 区域，2000年最终将其鉴定为 Lin5 基因(细胞质外蔗糖转化酶)，也经历了6年的时间。由于传统 QTL 图位克隆工作的难度，目前这方面虽然取得了突破，但无论是涉及到的作物种类、性状类型还是 QTL 的数量都是很有限的，尤其一些效应较小的 QTL 还没有被克隆出来。

3 作物数量性状基因图位克隆技术的发展

　　近年来植物基因组研究进展非常迅速，尤其拟南芥、水稻等模式植物高密度遗传图谱和物理图谱的构建、全基因组序列的公布、数以万计 EST、全长 cDNA 等序列及功能分析数据的释放以及新型植物分子标记及其高效检测技术的发展等，为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。Jander 等对拟南芥基因的图位克隆效率进行了分析，对比结果，1995年克隆1个基因大约需要3～5人年，而2002年后则不到1人年(拟南芥年繁殖5～6代)。同时这些新的进展也能够使 QTL 的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化，因此同样可促使 QTL 的图位克隆向更加简便、快速的方向发展。

3.1 作物 QTL 精细定位方法

　　传统图位克隆中的关键限制步骤是 QTL 的精细定位和通过染色体步移获得目的 QTL 区域的物理图谱，这一过程相当费时、费力。现在公共数据库中大量的序列资料为这一工作的顺利完成提供了便利。比如，当水稻某一 QTL 初步定位在2个标记之间后，就可以从国际水稻基因组测序计划 (IRGSP) 公布的序列中下载这2个标记区域的部分 PAC/BAC 克隆序列，利用软件 SSRIT 搜索克隆序列中的微卫星序列，然后选择合适的微卫星序列进行特异 PCR 引物的设计；也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较，如寻找 RGP 数据库(粳稻)与中国华大数据库(籼稻)的序列差异，设计单核苷酸多态性 (SNP) 标记和缺失/插入多态 (Del/In) 标记等，利用这些标记对大群体进行分析，可以迅速地将目标 QTL 范围缩小到一个很小的基因组区域。在完成精细定位后，可以根据已有的与目标 QTL 紧密连锁的分子标记在已公布 RGP 物理图谱上的位置，通过序列的拼接，实现目标 QTL 区域遗传图谱和物理图谱的电子整合，很快得到该区域的基因组序列，从而可以减少文库构建、筛选等繁重的工作，加速 QTL 的克隆进程。近来还有些学者提出一种更加简单的“高尔夫球逼近法” (Genegolfing) 进行基因克隆，其做法是从与目标性状松散连锁的分子标记出发，把标记与基因间的遗传距离换算成物理距离，“一杆”即能到达可能包括目标基因的重叠群，再从该连锁群中分离单拷贝序列作为探针或设计引物，对目标基因重新定位，如果发现目标基因不在该重叠群上，则可继续“第二杆”，反复如此，直至分离到含有目标基因的克隆为止。不过这种方法能否用于 QTL 克隆，还需实践验证。

3.2 作物 QTL 图位克隆的作图群体

　　在作图群体方面，近等基因系、染色体片段替换系或导入系是植物 QTL 克隆的关键基础材料。目前，水稻、番茄和油菜等作物已建立了多个染色体代换系群体，但大多数代换系群体的供体较少，且每个代换系含有多个片段，有些覆盖率也不高，因此 QTL 鉴定效率不高。本实验室以24个水稻品种为供体，利用回交和微卫星标记辅助选择相结合的方法，建立了以籼稻品种华粳籼74为背景的水稻单片段代换系 (Single segment substitution lines，SSSLs) 群体，目前获得的单片段代换系已超过1000个，覆盖了整个水稻基因组。由于单片段代换系是用分子标记辅助选择技术建立的近等基因系，在每个单片段代换系的基因组内都只有来自供体亲本的一个纯合染色体片段，而基因组的其余部分与受体亲本相同，所有在单片段代换系与其受体亲本之间的差异以及在单片段代换系之间所有可遗传的变异都只与代换片段相联系。单片段代换系在 QTL 的鉴定与定位、克隆及功能研究方面具有重要的利用价值。第一，利用覆盖全基因组的单片段代换系群体可以实现对目标性状进行全基因组的 QTL 鉴定，全面了解重要农艺性状的遗传基础，席章营用326个单片段代换系在两季共检出24个农艺性状的701个 QTL，平均每个性状检出了29.21个 QTL ；第二，由于消除了遗传背景的干扰，QTL 的效应被相对“放大”，如在常规分离群体中，fw2.2 对番茄果重变异的贡献为5％～30％，而在 NILs 发展的 F₂ 群体中其作用达到47％，这样就从遗传和统计两个方面保证了 QTL 定位的准确性和稳定性；第三，在鉴定出 QTL 后可以立即通过相关的单片段代换系与受体杂交发展大样本的分离群体进行 QTL 精细定位，也可以通过进一步的回交和分子标记辅助选择选育次级单片段代换系，并通过重叠作图的方法进一步缩小 QTL 区域；第四，在候选基因确定后，还可设计引物扩增候选基因区域，测序后通过对不同供体来源的单片段代换系在同一基因组区域的序列和表型差异进行比较，寻找变异位点，并对候选基因功能进行验证，拟南芥中一些基因的功能就是通过这种方法研究的。此外，单片段代换系之间的相互杂交还可以研究 QTL 之间的遗传互作；单片段代换系与其他品种杂交可以研究 QTL 与不同遗传背景的互作。

4 结论

　　自 Peterson 等首次对 QTL 进行全基因组扫描以来，已有许多学者用不同的作图群体，采用不同的统计分析方法定位了许多作物 QTL，但其中只有很少几种作物的几个效应较大的 QTL 被克隆。原因主要有二，一是数量性状基因表达非常复杂，用现有作图方法(包括遗传模型、作图群体等)对 QTL 的定位能力有限，难以获得 QTL 的正确位置；二是传统的克隆方法过于复杂和困难。近年来在植物基因组学研究领域所取得的成果无疑将大大促进 QTL 的克隆研究。QTL 的鉴定和分离已成为21世纪遗传学研究的主要方向之一，同时也是后基因组学的重要任务，相信随着相关研究的不断深入，在不久的将来，主要农作物会有更多新的 QTL 被克隆。

    注：
    （1）文章来源：植物遗传资源学报，2005年 第6卷第4期；
    （2）作者单位：华南农业大学/广东省植物分子育种重点实验室。