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微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物。按作用机理不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统的微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因表达，促进植物生长。其中具代表性的有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等。

1 Bt杀虫晶体蛋白

苏云金芽孢杆菌能产生一种具有杀虫作用的晶体蛋白。昆虫取食后，晶体蛋白(前毒素)在昆虫碱性肠道内溶解，经过中肠蛋白酶的消化作用，将前毒素降解为活性蛋白，活性蛋白插入昆虫中肠细胞膜，形成跨膜离子通道或孔，导致细胞溶解，最终使昆虫死亡。

1957年苏云金杆菌制剂首次上市销售，目前商品制剂已达100多种，是世界上产量最大，应用最广的微生物杀虫剂。近20年以来，通过基因工程改良微生物农药菌株、结合高新发酵工程技术的研发途径，使Bt农药产业的技术创新取得了长足的发展，越来越多的Bt系列农药投入农业生产应用，特别是在Biosis、Ecoscience、Biotech、Mycogen、Ecogen和EDEN等高新科技公司的推动下，微生物蛋白农药得到了快速发展，并取得了卓越的成就，如Mycogen公司利用基因工程技术，开发出包括MVP(Kurstaki-CryIAC)、M-Trak(Sandiego-Cry3A)、M/C(Aizawai-CrylC)等一系列Bt新产品，年销售额达到1亿美元。

2 新型微生物蛋白农药

近年来，从植物病原菌中发现了具有诱导植物广谱抗性和促进生长的多功能蛋白激发子。微生物蛋白农药通过诱导植物本身的抗病基因表达而起到抗病防虫促进生长的作用，有关微生物蛋白农药的研究正逐步成为生物农药发展的一个重要内容。

2.1 过敏蛋白Harpin

过敏蛋白是由解淀粉欧文氏菌产生的一种引起植物过敏反应的蛋白质，由300～400个氨基酸组成，其分子量约为40kD，可诱导植物体内一系列基因的表达，诱导植物自身的生长系统和防卫系统，从而抵御多种病害的侵染和具有促生增产等功效。

1992年，韦忠民等研究的植物病原解淀粉欧文氏菌过敏蛋白的序列及其基因，并首次提出过敏蛋白诱导植物HR与抗病性的关系，提出了过敏蛋白具有诱导抗病功能，促进了新型微生物蛋白农药研究的兴起。2001年美国Cornell大学和EDEN生物科技公司基于对过敏蛋白的研究，共同开发和成功研制出具有抗病防虫功能的广谱性微生物蛋白农药Messenger。该产品是2001年生物农药中最具代表性的新产品之一，也是当前国际上利用高新技术手段开发生物农药最成功的例子。该产品在多种大田作物、经济作物上应用后，抗病增产效果十分显著，对多种病虫害防治效果达50%～80%，增产效果10%～20%。这类农药功能广泛，作用机制独特，对环境友好，有关研究荣获了2001年度美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。

国内赵立平等研究证实了细菌蛋白质具有提高植物抗病虫和促进植物增产的功能，并研究了Harpin的结构与功能关系、Harpin固氮工程菌的构建、产Harpin成团泛菌工程菌的构建等方面的研究。李汝刚、范云六等进行了Harpin蛋白基因的克隆、序列分析及 Harpin蛋白转基因马铃薯对晚疫病抗性研究。闻伟刚、王金生等研究了水稻白叶枯病菌Harpin基因的克隆与表达；对水稻黄单胞杆菌hrp基因簇进行了全序列测定，发现其中含有23个hrp调节基因和hrp基因簇(24个基因)；从水稻黄单胞杆菌和水稻中分离了10余种抗病激活蛋白编码基因，从水稻条斑病菌的Ⅲ型泌出系统突变体M51中分离、纯化到激发烟草过敏性反应的活性蛋白；对来源于水稻白叶枯病菌中编码植物HR反应激发子HarpinXoo蛋白的基因hrfAXoo进行了功能域分析，已从水稻中克隆到12种信号调控基因；并进行了水稻黄单胞杆菌两个致病变种(Xoo和Xooc)中Harpin蛋白的比较遗传学研究，发掘出编码HarpinX的功能基因，通过转基因手段实现了基因在植物中的高效表达，具有显著的防病效果。

2.2 隐地蛋白Cryptogein

Huet等将从隐地疫霉、樟疫霉和辣椒疫霉中纯化的分子量约10kD的多种蛋白类激发子命名为Elicitin。这是一类特殊的外泌、小分子耐热蛋白，等电点为9.8，由98个氨基酸组成。可诱导茄科的烟草和十字花科的油菜和萝卜产生过敏性坏死和诱导抗性等防御反应。研究证明，Elicitin是通过水杨酸介导抗病信号途径，激发植物获得对真菌、细菌等病原物的系统抗性(SAR)，同时产生活性氧自由基、脂过氧化物、植保素、PR蛋白等防御反应相关物质。迄今已发现17种疫霉菌中存在Elicitin活性蛋白，根据等电点和对烟草的激活反应可分为α-elicitin(酸性)和β-elicitin(碱性)两类，两种类型蛋白的氨基酸序列同源性达到60%以上。近年来从一些腐霉菌中也发现有Elicitin类活性蛋白存在，并能高效激发番茄的系统获得性抗性。

隐地蛋白是由隐地疫霉分泌产生的蛋白类激发子。因隐地蛋白在极低浓度(100 pmol/ml)下就能诱导烟草产生HR，并使植株获得广谱抗病性，同时产生与防卫反应相关的物质如乙烯、植物保卫素、PR蛋白等，所以倍受植物病理学家和育种工作者的重视，并得到了较为系统的研究，在氨基酸序列、空间结构、寄主与非寄主抗病性、作用机理、作用靶标、结构与生物活性的相关性以及抗病基因工程等方面取得了较大的进展。法国的Tepfer等首次将隐地蛋白基因成功导入烟草，植株表现抗黑胫病作用。

国内也开展了Elicitin相关研究，研究热点集中在基因的克隆和表达上。蒋冬花等克隆了隐地蛋白基因，构建植物表达载体，转化烟草，表达抗黑胫病作用。2000年研究还发现，隐地蛋白13位上的赖氨酸在诱导细胞死亡中起着关键的作用。谢丙炎等系统研究了苎麻疫霉诱抗激发蛋白的理化特性、功能及其基因结构，发现该蛋白对辣椒抗疫病有诱导抗性作用，并首次发现Elicitin基因存在断裂现象。用低浓度激发素处理茄科、十字花科等多种非寄主植物可诱导产生HR，并使植物获得对病原物的系统抗病性。张宏明等从棕榈疫霉的培养滤液中分离出分子量为10.6kD的不含糖基的耐热蛋白。这种10.6kD蛋白能诱导烟草叶片过敏性坏死反应，用该蛋白处理的烟草叶肉、表皮和保卫细胞，以及悬浮培养细胞在产生过敏性坏死反应之前，均有H₂O₂的大量生成，推测这种10.6kD蛋白也属于Elicitin类激发子。

2.3 激活蛋白Activate Protein

激活蛋白是从交链孢菌、纹枯病菌、黄曲霉菌、葡萄孢菌、稻瘟菌、青霉菌、木霉菌、镰刀菌等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白。氨基酸和核苷酸序列分析表明这种蛋白不同于过敏蛋白和隐地蛋白(表1)，我们根据其作用机理将此蛋白命名为真菌激活蛋白(Activator Protein)。该蛋白不诱导烟草植株的过敏反应，这与Harpin和Elicitin均对烟草植物产生过敏反应不同。其对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫的控制效果在75%以上，并能促生增产。激活蛋白处理种子能够加快黄瓜种子的萌发，促进幼根的生长。我们还发现该蛋白制剂能够以特定的作用方式成倍地提高Bt对鳞翅目害虫的防治效果。激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力；通过激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长和叶绿素含量提高，从而达到提高作物产量的目的。　　

表1 几类新型微生物蛋白农药的对比

类型

来源

专利

分子量
（kD）

过敏反应
（烟草寄主）

过敏蛋白（Harpin)

细菌（ Erwinia）

美国专利1992年

30－40

有

隐地蛋白（Cryptogein)

卵菌（Phytophthora）

法国专利1985年

10－15

有或无

激活蛋白（Activator）

真菌（Alternaria）

中国专利2000年

40－70

无

2.4 其他相关蛋白

张正光等从引起棉花烂铃的苎麻疫霉培养滤液中纯化出一种特异的90kD蛋白激发子，并研究了该蛋白激发子诱导烟草过敏反应过程中细胞死亡和防卫反应酶系活性变化及对病程相关蛋白PR5的诱导作用。以10nmol/L激发子溶液注射处理W38烟草叶片，HR枯斑周围5mm组织在UV光下呈现蓝色荧光，对处理部位进行Evans blue染色，结果发现20小时处理部位细胞全部死亡；激发子可诱导提高烟草防卫反应中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性和诱导PR5基因的转录。上述结果表明90kD蛋白激发子可诱发烟草的细胞死亡、苯丙烷代谢和PR基因的表达等多条信号途径。

2001年Veit等在瓜果腐霉细胞壁中分离到一种新的蛋白类激发子，能诱导双子叶植物产生多种防卫反应，但对单子叶植物无活性；该蛋白是许多微生物如卵菌、细菌、真菌等细胞壁的共有成分。

3展望

微生物蛋白农药作用机理在性质上类似动物免疫的一种诱导抗性，对于多种作物具有诱导抗病虫和增产效果。近年来，随着具有此类生物活性的各种微生物被不断发现，对其活性功能基因的进一步发掘、及其作用机理的深入研究，新型微生物蛋白农药的作用日益受到重视。其产品本身无毒，不引起病虫害的抗药性，在植物体内和土壤中易分解，无残留，可大幅度提高农产品质量和国际竞争力，是农业健康生产技术体系中一种新型环保生物蛋白。

注：
    （1）参考文献：略；需者与本站联系，或到中国水稻研究所图书馆查阅；
    （2）文章来源：中国生物防治，2004年第20卷第2期；
    （3）作者单位：中国农业科学院生物防治研究所。　　　　

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